今回は清華大学合成・システム生物学センター主任の陳国強教授チームを推薦します。代謝工学前の記事：Engineering low-salt growth Halomonas Bluephagenesis for cost-effective bioproduction combined with adaptive evolution 。本研究は常圧室温プラズマ技術（ARTP）を用いて、青結晶塩単胞菌に対してランダム突然変異を行い、スクリーニングして低塩濃度で良好に成長した菌株を得た。得られた優勢菌株に対して発酵生産PHAを行い、多収量とコスト低減の二重利得を実現した。突然変異菌株と野生型遺伝子型を比較し、好塩宿主菌株の塩ストレス関連遺伝子を明らかにした。

ポリヒドロキシ脂肪酸エステル（Polyhydroxyalkanoates、PHA）は細菌中のエネルギー貯蔵用ポリマーであり、緑色生分解型プラスチックとして開発できる。それは化学工業プラスチックの物化特性を備えているが、生物分解性、生体適合性、光学活性、ガス分離性などの一連の性質を持っている。PHA生産菌株の好塩性単胞菌TD 01は中国新疆艾丁格爾湖から分離された好塩菌であり、高pHと高塩濃度で非無菌条件下で急速に成長することができる。現在では発現ベクターやプロモーターなどの面で青色塩単胞菌を改造して高性能菌株を得ているが、その耐塩調節の面ではまだ多くの未知が存在する。一方、青結晶塩単胞菌の逆改造、例えば低塩、高pH生存は、塩廃水処理コスト、より高い細胞分離度、より高いPHA精製度をさらに下げることができる。

一方、細胞体内で生物過程の制御に関与している細胞蛋白質は通常、塩度の浸透圧、熱ショック、紫外線照射などの外部圧力に対応するために異なる分配戦略を示しており、代謝ネットワークの理性的な設計に対して塩ストレスの調節を得ることは一定の難度が存在する。常圧室温プラズマ技術（ARTP）は全ゲノムランダム突然変異方法であり、微生物の耐塩性のメカニズムはシステムレベルの制御ネットワークに関連しているため、全ゲノムのランダム突然変異を実現できるARTPは青色塩単胞菌のシャーシ改造に適している。

研究者は野生単胞菌TD 01及び3つの組換え菌TDH 4、TD 68、TD 68-1994を出発菌株とし、それぞれ高濃度（50 g/L NaCl）と低濃度（10 g/L NaCl）塩環境下での成長状況を検証した結果、すべての菌株は低塩濃度の平板にコロニーが現れていないことを示した（図2）。この4株の菌に対してARTP変異誘発を行い、変異誘発時間は5分、致死率曲線は最適処理時間は3分を示した（図2）。変異誘発後のライブラリから低塩濃度で最も急速に成長した4株の菌を選別し、第2次変異誘発を行い、最後に4株の菌：TD 01 Aを得た₂B₅、TDH4A₁B₅、TD68A₂B₃TD68-194Aについて₁B₅（図2）。ただしTDH 4 A₁B₅菌は優れた生産性を持ち、細胞幹重量は11 g/Lに達することができ、60質量%のPHA収量を含む。

対突然変異菌株TDH4A₁B₅遺伝子レベルの改造を行い、phaCABオペレータを加え、代謝フラックスを増強し、7 L系で行った40時間の未滅菌補材をバッチ発酵させ、野生型のPHBとP 34 HBの生産量に比べてそれぞれ21%と36%増加した（図3）。さらにそれを改造することで、トレオニン分泌率と外分泌素分泌率はそれぞれ50%と77%向上し、多方面の解析はその低塩濃度シャシー菌の応用潜在力を示した（図4）。遺伝子比較により、浸透圧に関連する101個の遺伝子を含む好塩宿主菌株の塩ストレス制御機構を明らかにした。さらに重要なのは、組換え好青色菌TDH 4 A 1 B 5を使用することにより、7 L発酵系下のPHAのコストが1/3削減され、その経済競争力が著しく向上したことである（図5）。

図1 本文の技術路線図

図2 アートプゆうどうデータ

図3 対H. ブルーファゲネシスTDH4A₁B₅の改造による高生産性PHA

図4 対H. ブルーファゲネシスTDH4A₁B₅の改造多種類の蛋白質の生産に応用する

図5 低塩発酵と高塩発酵のコスト分析

論文リンク：

https://doi.org/10.1016/j.ymben.2023.08.001