一、放線菌

放線菌（Actinomycetes）は原核生物類群であり、自然界に広く分布し、極めて重要な微生物資源であり、人類の生産と生活関係と極めて密接であり、際立った特性は大量の、種類の多い抗生物質を産生できることである。放線菌は分枝菌糸と分生胞子を形成でき、菌糸状に成長し、主に無性胞子を形成することによって繁殖し、菌体分裂断片によって繁殖することもできる。放線菌は一定の段階まで成長し、一部の気生菌糸は胞子糸を形成し、胞子糸が成熟すると分化して多くの胞子を形成し、分生胞子と呼ばれる。

図1放線菌パターン図

図2放線菌の気生菌糸と胞子糸

胞子はその体積が小さく、質が軽く、飛散しやすいなどの特徴により、同じ固体平板上の異なるモノクローナルコロニー間に交差汚染問題が発生しやすく、放線菌の培養と分離に大きな挑戦をもたらした。

天木生物の高スループットマイクロアップグレード液滴培養グループ学システムであるMISS cellは、細胞（胞子）を液滴に包み、独立した培養ユニットを形成し、菌糸または胞子が他の液滴モノクローナル内に飛散することを回避し、それによって菌株間の交差汚染問題を克服し、放線菌モノクローナルを得る効率と純度を高めることができる。本実験は菌糸体に基づいて放線菌の分離と培養を実現し、胞子を産生しない糸状菌の分離培養に分離培養方法を提供する。

二、MISS cellを用いた放線菌の分離培養

1.試料の前処理、上機濃度の決定

放線菌菌糸体（30℃、4日間培養）を収集し、ガラス株を加えて菌糸を砕いて濾過し、血球計数板で計数し、BM培地でサンプル濃度を500-1000 CFU/mLに希釈し、作業フローは以下の通り：

図3サンプル処理ワークフロー

2.MISSセル分離培養

本実験では合計2500個の液滴を生成し、96 h培養後に検査と選別を行い、60分間の選別を経て、菌含有液滴約500個を得た。MISS cell計器の動作フローは下図の通りである。

図4 MISS cellワークフロー

3.実験結果

1）成長速度の比較：異なる時点で液滴及び平板放線菌の成長状況を観察し、液滴培養1日後に液滴中に成長が現れ、平板培養6日後に菌糸の成長が現れ、液滴培養放線菌の成長速度は平板培養より顕著に優れ、放線菌の最適培養時間は4日である。

図5固体平板上での放線菌の成長状況

図6液滴における放線菌の成長状況

2）放線菌液滴選別結果図

図7放線菌培養4日間、ODモードでの選別状況

図8放線菌培養4日間、蛍光モードでの選別状況

三、天木生物MISS cell計器は放線菌の分離、培養とスクリーニング過程に高スループット、高効率自動化ソリューションを提供する

本研究では天木生物のMISSセル計器を用いて、合計2500個の液滴を生成し、選別して単コロニー約500個を得て、放線菌の自動培養と選別を実現し、有効に菌株間の交差汚染を回避した。同時に、胞子を産生しない糸状菌に対しても分離培養方法を提供した。今回の実験では合計8 mlの培地を消費し、全過程を自動化して液滴生成、培養、スクリーニングを96ウェルプレートに実現し、モノクローナル取得効率を大幅に向上させるとともに、交差汚染問題を効果的に回避し、放線菌のモノクローナルスクリーニングに高効率ツールプラットフォームを提供した。

天木生物MISS cell計器は放線菌を含む胞子を内包する細菌であり、モノクローナル培養と高スループットスクリーニングの高効率自動化実験プラットフォームを提供し、菌株の培養とスクリーニングに強力な支持を提供した！