今回は江南大学未来食品科学センターの周景文副主任教授チームがSynthetic and Systems Biotechnologyに発表した記事をお勧めします：Synergetic engineering of Escherichia coli for efficient production of L-tyrosine。本研究は協同工程策略を通じて、シキミ酸経路に対して代謝過程を微調整し、そして実験室適応進化（MMC）を利用して菌株の酸性条件に対する耐性を高め、最終的に最適化された菌株を獲得し、5リットル発酵タンク中62時間以内に92.5 g/LのL-チロシンを産生でき、L-チロシンの工業化生産に重要な意義を持っている。

L-チロシンは食品、飼料、化学工業、製薬業界において広範な応用を持っており、それはコーヒー酸、フラボノイド、クルクミンなどの多種の天然産物の前駆体であるだけでなく、パーキンソン症候群を治療する薬物L-DOPAの合成にも関連している。L−チロシンは重要な工業的価値を持っているが、伝統的な化学合成または酵素法によるチロシン生産プロセスはコストが高く、安定性が悪いという欠点がある。微生物発酵法によるチロシン産生はコストが低く、操作が簡単であるなどの利点があるが、収量が低く、高密度発酵菌株が安定していないなどの欠点もある。

研究者は大腸菌WSH-Z 06を出発菌株とし、フシギ酸と芳香アミノ酸の蓄積に関連するいくつかの遺伝子に対して発現とノックアウトの混合検証を行い、4つの遺伝子を組み合わせて過発現と3つの遺伝子ノックアウトを行った菌株を得て、48 hフラスコL-チロシン収量は4.22 g/Lに達した（図2）。次いで、そのシキミ酸経路にリン酸デケターゼ経路（PK）を添加すると、フラスコ中の菌株のOD 600は9.8%上昇したが、全体のL−チロシン収量は低下傾向を示した。2つのNADHとNADPHが相互に形質転換された遺伝子を統合した後、得られた菌株の生産量は6.17 g/Lに上昇した（図3 a）。この菌株を5 L発酵槽レベルで発酵させると、L-チロシンの生産量は50.2 g/Lに達し、同時に発酵液中に12.4 g/Lの酢酸が検出され（図3 b）、高濃度酢酸により菌体成長が明らかに抑制された（図3 b）。

酢酸の蓄積を減らすために、大腸菌酢酸生産経路遺伝子をノックアウトし、得られた菌株酢酸生産量は33.6%減少し、菌体成長はわずかに改善された。酢酸に対する耐性をさらに向上させ、リジンの生産率を高め、MMC（微生物液滴連続継代進化計）を用いて適応的に進化させ、液滴系下で200個を超える液滴に対して50回の継代スクリーニングを行い、酢酸濃度を絶えず高め、pH 5.1下で良好な菌株を得、好ましくはフラスコレベルの生産量は7.11 g/Lである（図4）。5 L発酵槽中でグルコース濃度と溶存酸素を制御することにより、最終的にL-チロシン収量は92.8 g/Lに達した。

この一連の総合的なエンジニアリング戦略は微生物合成におけるL-チロシンの生産量を顕著に推進し、工業級生産に有力な実験支持を提供した。

図1グルコース生合成L-チロシン経路

図2ノックアウトおよび過剰発現遺伝子後のリジンの収量

図3菌株フラスコと5 L発酵タンクの発酵結果の最適化

図4大腸菌酢酸系の改質と耐酸性の進化

記事リンク：https://doi.org/10.1016/j.synbio.2023.10.005