まえがき

微生物個体は微小で、構造が簡単で、進化の地位が低く、分布区域が広く、異なる生存環境で進化してそれぞれの特色のある生態系を形成した。土壌微生物の群落構造特徴の相関分析は土壌微生態の面から作物栽培コストを下げ、品質を高めるために重要な実践意義がある。同時に複雑な生存環境は土壌微生物に豊富な生物多様性の生物学的メカニズム及び代謝経路をもたらし、新型生物活性物質の生産に大きな潜在力を持たせた。

しかし、複雑な土壌微生物菌群から適切な菌株をスクリーニングすることは、常に仕事量の大きい任務である。伝統的な方法による菌種選別の一般的な手順は：菌種採取→濃縮培養→純種分離→性能測定→菌種保存であり、この方法の手順は煩雑で時間がかかり、巨大な仕事量と重複労働を投入する必要がある。そのため、スクリーニング効率を高めるために、科学研究者は絶えず新しいスクリーニング理論と自動化設備を構築し、多くの方法もすでに土壌微生物のスクリーニング分野、例えば変性勾配ゲル電気泳動法、リアルタイム蛍光定量PCRとマイクロアレイなどに応用することに成功した。

天木生物高スループットマイクロアップグレード液滴培養グループ学システム（single cell microliter-droplet culture omics system、MISS cell culture omics）は液滴マイクロフロー制御技術に基づいて開発されたマイクロ化高スループット単細胞培養及び選別装備であり、環境菌群に対して単細胞レベルで分離培養を行うことができ、液滴生成後に高通気性管路に保存してインキュベートを行い、最後に光学信号（OD、蛍光、化学発光など）によって検査選別を行い、選別後の液滴は多孔質板に入り、後続の実験に用いる。

じっけんてじゅん

本事例は天木生物高フラックスマイクロアップグレード液滴培養グループ学システムを基礎として土壌微生物の効率的なスクリーニングモデルを構築した。

今回の実験サンプルは野外土壌であり、2 gのサンプルを採取し、5倍の体積の生理食塩水とガラスビーズを加え、4℃で一晩震動した。静置沈降後に上清を採取し、血球板で計数し、上清中の菌含量に基づいて3つの濃度勾配（サンプルA、B、C）に希釈し、上機で液滴を生成し、室温で培養した。同時にMISS cell上のサンプル濃度の5倍に基づいてそれぞれサンプルD、E、Fを作成し、平板を塗布し、室温で培養し、コロニー数を統計した。

液滴盤培養15-45日間、60882個の液滴から菌付き液滴5628個を選別し、同時に平板を塗布して88個、統計集落数は761個であった。シーケンシングの結果、原始土壌では1264種類の菌が検出され、液滴系では86種類の菌が検出され、平板系では73種類の菌が検出された（図2）。その中で、液滴中にプレート中で得られなかった50種類以上の菌株が同定され、ブルステナイト菌、欠陥短波単胞菌など7種類の菌が液滴中にのみ濃縮されている。同時に、液滴は単細胞被覆後培養であるため、収集液滴の95%以上は同定後に保存することができる。

結論

本事例はOD閾値をスクリーニング根拠とし、土壌中の多種微生物を有効に分離し、86株の異なる微生物を検出することに成功し、従来方法のスクリーニング種類より17.8%高く、同時に人件費を大幅に削減した。この方法は土壌微生物分離におけるマイクロフロー制御スクリーニングシステムの有効性を証明した。

図1土壌微生物スクリーニング実験フロー

図2原始土様、液滴及び平板濃縮の細菌配列決定結果

図3原始土様、液滴と平板濃縮の細菌種類の違い