要約

新生マウスの網膜生体電気変換技術は網膜発育及び疾病研究に重要な手段を提供する。研究はウィニドGene Pulser 830方形波型電気穿孔器を用いて、電気転化パラメータを最適化し、新生マウス網膜における外来遺伝子の効率的な送達と発現を実現し、トランスフェクション効率を著しく向上させ、網膜関連基礎研究及び転化医学に信頼できる技術プラットフォームを提供する。

はじめに

網膜は視覚信号伝達の重要な組織として、その発育メカニズム及び疾病発生メカニズムの研究はずっと眼科分野のホットスポットである。新生マウスの網膜は急速な発育段階にあり、この時遺伝子操作を行うことは網膜細胞の分化、移動及び機能確立における遺伝子の役割を効果的に研究することができる。しかし、伝統的な遺伝子送達方法は生体網膜操作において効率が低く、細胞損傷が大きいなどの問題があり、正確な科学研究ニーズを満たすことが難しい。

電気変換技術はパルス電場を通じて細胞膜の透過性を瞬時に変化させ、外因性核酸などの高分子を細胞に入れ、生体組織遺伝子の送達に優位性を示した。ウィニドGene Pulser 830角波型電気穿孔器はその先進的な角波パルス技術、知能監視システム及び柔軟なパラメータ設定によって、新生マウス網膜生体電気転化に高効率で正確な解決方案を提供し、科学研究者が伝統技術のボトルネックを突破するのを助けた。

材料と方法

1.実験動物

生後0〜2日（P 0〜P 2）のC 57 BL／6 J新生マウスは、本実験室のSPF級動物房により提供され、飼育環境温度（22±2）℃、湿度50〜60%、12時間の光照射／暗循環を行った。

2.主な試薬

プラスミドDNA（目的遺伝子GFPを含み、本実験室によって構築された）、ある試薬（電気転移緩衝液の調製に用いられ、NaCl、KCl、グルコースなどの成分を含み、pH値は7.4に調整された）、麻酔剤（イソフルオロカーボン、マウス麻酔に用いられる）、消毒試薬（75%エタノール）。

3.主要機器

ウィニドGene Pulser 830角波型電気穿孔器、体視顕微鏡（あるブランド、手術操作観察用）、顕微鏡注射針（外径10-15μm、プラスミド注射用）、恒温加熱板（マウス体温維持）。

実験手順

1.マウス麻酔と固定

新生マウスをイソフルラン含有麻酔箱に入れ、麻酔を誘導した後、恒温加熱板に移し、体温を安定させた。マウスの頭部と四肢をテープで軽く固定し、手術中のマウスの体位の安定を確保した。

2.網膜定位とプラスミド注入

体視顕微鏡下で、目的遺伝子を含むプラスミドDNA（濃度1〜2μg／μL）を微量サンプリング針で吸収し、マウス眼球側頭側角膜縁から針を入れ、ゆっくりと針先をガラス体腔に挿入し、水晶体を避け、正確に5〜10μLプラスミド溶液を網膜下腔に注射した。注射中は針の深さと速度を制御し、網膜組織を損傷しないように注意してください。

3.電気穿孔パラメータの設定と操作

ウィニドGene Pulser 830方形波型電気穿孔器は事前プログラミング最適化システムを採用し、新生マウス網膜組織の特徴に対して、哺乳動物細胞トランスフェクションモードを選択し、内蔵した網膜細胞推薦パラメータを呼び出した：方形波パルス、電圧はマウスの年齢と眼球の大きさによって調整し（一般的には50-80 V）、パルス時間は10-20 ms、パルス回数は3-5回、パルス間隔は1-2 sである。

オーダーメイドのピンセット型電極（電極間隔1-2 mm、表面は絶縁処理を経て、電流漏れを避ける）をマウス眼球に軽く挟み、電極が眼球表面に密着し、眼球を圧迫しないことを確保する。足踏みスイッチを通じて電気穿孔プログラムを起動し、計器の10インチタッチスクリーンはリアルタイムでパルス波形とパラメータ動態を表示し、実験者が全過程を監視するのに便利である。電気穿孔過程中、計器は自動的に知能インピーダンス検査を行い、プリパルスはサンプルの抵抗を測定し、動的にパラメータを調整し、毎回の電撃条件が網膜細胞の状態と整合することを確保する。同時に、アーク防護と極性転換技術はアーク損傷を根絶し、細胞膜電荷障壁を突破し、難トランスフェクション細胞の成功率を向上させた。

4.術後処置

電気回転操作が完了した後、マウスを母マウスのそばに戻し、環境の温かみと静かさを維持した。術後毎日マウスの眼部状態及び生存状況を観察し、感染及びその他の合併症の発生がないことを確保した。

結果と議論

トランスフェクション効率検出

電気転移後3日間、マウスの眼球を採取し、網膜凍結切片を作製し、蛍光顕微鏡により緑色蛍光蛋白（GFP）の発現状況を観察した。その結果、網膜各層の細胞には明らかなGFP蛍光信号が見られ、特に神経節細胞層、コア層、外核層は、トランスフェクション効率が伝統的な方法より40%以上向上した（ウィニド内部試験データに基づく）。これはウィニドジーンPulser 830方形波型電気穿孔器の高強度電場により細胞膜透過性を瞬時に再形成し、核酸高分子の効率的な送達を実現した。

細胞生存と組織損傷の評価

蘇木精−伊紅（HE）染色による網膜組織構造の観察、電気転写群マウス網膜の各層構造は明らかで、細胞配列は整然としており、対照群と比較して、明らかな細胞壊死あるいは炎症反応は現れなかった。台望藍拒絶反応実験によると、電気転移後の網膜細胞の生存率は90%以上に達し、この電気転化技術は網膜組織への損傷が小さく、後続実験の実行可能性を保証したことを示した。

従来技術との比較優位性

従来のウイルスベクタートランスフェクション方法は製造周期が長く、コストが高く、ベクター容量が限られているなどの問題があり、免疫反応を引き起こす可能性がある。一方、威尼徳Gene Pulser 830方波型電気穿孔器が媒介する生体電気変換技術は、ウイルス包装を必要とせず、DNA、RNA及び蛋白質などの高分子を直接送達でき、操作が簡便で迅速で、コストが低く、同時にウイルス担体の潜在的リスクを回避した。その全波形知能監視システムは実験過程の透明性と制御性、データの遡及性を確保し、科学研究結果の正確な再現を支援する。事前プログラム最適化システムは常用細胞株パラメータライブラリを内蔵し、ワンタッチで呼び出すとともに、カスタムパルスパラメータをサポートし、新生マウス網膜などの複雑なシーンに適応し、強大な柔軟性と適用性を示す。

テクノロジーの最適化と考慮事項

実験の過程で、電気穿孔パラメータの最適化はトランスフェクション効率に影響する重要な要素であることが分かった。電圧が高すぎるか、パルス回数が多すぎると細胞損傷を引き起こす可能性があり、電圧が低すぎるとトランスフェクション効率が不足する。ウィニドGene Pulser 830のインテリジェントインピーダンス検出機能はサンプル抵抗に基づいてパラメータを動的に調整することができ、この問題を効果的に解決した。また、注射プラスミドの濃度と体積、電極の貼り合わせ程度及びマウスの日齢はいずれも実験結果に影響を与え、実験条件を厳格に制御する必要がある。

将来性の適用

基礎研究の分野

この技術は広範に網膜発育関連遺伝子の機能研究に応用することができ、例えばCRISPR遺伝子編集技術は電気転化と結合し、網膜特定遺伝子のノックアウトまたは打ち込みを実現し、網膜細胞分化、神経ループ形成におけるその作用を研究することができる、siRNA送達は標的遺伝子の発現を抑制し、網膜疾患発生における遺伝子のメカニズムを探索するために用いることができる、幹細胞再プログラム研究において、電気転化技術は再プログラム因子を網膜幹細胞に効率的に導入し、網膜再生医学研究に新しい道を提供することができる。

転化医学分野

生体腫瘍の電気転移において、網膜母細胞腫などの眼部腫瘍に対して、電気転化を通じて治療性遺伝子または薬物を送達し、正確な標的治療を実現することができる、ワクチン開発において、電気変換技術は抗原遺伝子を網膜関連免疫細胞に送達し、免疫反応を誘導し、眼部ワクチン研究に新しい構想を提供することができる、体内遺伝子治療の面では、遺伝性網膜疾患、例えば色素性網膜炎、先天性黒蒙症などに対して、電気転化技術は正常な遺伝子を網膜細胞に導入し、遺伝子治療の臨床応用のために基礎を築くことができる。

農業と工業分野

研究は新生マウス網膜に焦点を当てているが、ウィニドGene Pulser 830角波型電気穿孔計の広範な適用性は農業と工業分野にも大きな潜在力を持つようにしている。植物遺伝改良において、植物原形質体の遺伝子送達に用いられ、農作物の品種改良を加速することができる、酵母工学菌構築及び微生物代謝工学において、電気転化技術は外因性遺伝子導入を効率的に実現し、工学菌の生産効率を高めることができる。

ウィニドジーンPulser 830角波型電気穿孔器は、革新的な角波パルス技術、インテリジェント監視システム、深さの技術サービスサポートにより、500社を超えるトップ科学研究機関の信頼の選択肢となっている。基礎研究における正確な遺伝子操作であれ、転化医学における革新的な治療探索であれ、この装置は科学研究者に効率的で信頼性の高い技術プラットフォームを提供している。現在、ウィニドは無料技術方案コンサルティング及び製品試用サービスを提供し、科学研究者がトランスフェクション技術の障壁を攻略し、生命科学研究及び関連分野の発展を推進することを支援している。

参考文献

1.酸素誘導新生マウス網膜病変における血管新生と酸素ストレス関連遺伝子発現の変化[J]。余増洋、ゴン陳媛、張国慶。中国薬理学通報2014,010期

2.酸素誘導網膜病変新生マウスモデルにおける単核細胞ケモカイン-1の発現[J].董寧、ペリウム群、ショアリン。中華実験眼科雑誌2012,004期

3.酸素誘導網膜病変新生マウスモデルにおける単核細胞ケモカイン-1の発現[J].董寧、ペリウム群、ショアリン。中華実験眼科雑誌2012,004期

4.新生マウス網膜組織におけるMCP-1の発現変化と意義[J].董寧、ペリ群、肖林.山東医薬2011，第026期

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