病原性細菌感染は公衆衛生に深刻な脅威をもたらし、特に慢性と急性の創傷において、細菌の定植と生物膜の形成は創傷の癒合をより困難にする。活性酸素（ROS）に基づく治療法は広範な抗菌活性と低耐性の利点があり、現在では感染創面を治療する非抗生物質戦略となっている。しかし、その臨床応用は依然として投与効率が低く、細菌の標的性が悪く、治療後の炎症の暴走などの問題に限られている。

このため、武漢大学薬学部の黎威教授チームは多機能二層マイクロニードルパッチ（LFT/S-MN）を設計し、効果的に滅菌し、傷口の癒合を促進することを目的とした。このパッチは、正電荷を有するラクトフェリン系ナノ粒子（LFT NPs）をポルフィリン音響感受性剤（TAPPFe）と結合し、溶解可能な下地層中に配置するとともに、pH応答の針先層中に抗炎症薬spermidine（SPD）を装填する。マイクロニードルが感染組織に挿入されると、放出されたLFT NPsは負電荷細菌を効果的に標的化して凝集することができ、超音波刺激下で協同の化学動力和声動力療法（CDT/SDT）により大量のROSを生成する。同時に、創傷の酸性微小環境は針先層の段階的な分解を触発し、それによってSPDの制御放出を実現し、免疫調節を行う。緑膿菌（P.aeruginosa）感染のマウス創傷モデルにおいて、LFT/S-MNパッチは細菌負荷を著しく減少させ、炎症反応を抑制し、コラーゲン沈着と新生血管形成を促進し、創傷閉鎖を加速させた。

この仕事は将来性のある非抗生物質戦略を提案し、協同のCDT/SDTと炎症調節を通じて創傷抗菌と組織再生を実現する。このマイクロニードルパッチは、マイクロ立体リソグラフィ（PμSL）技術（microArch® S240，精度：10μm）3 Dプリント加工金型をPDMSで反転成形して製造し、関連研究成果は「Three-in-one bilayer microneedle patch for ultrasound-activated antibacterial therapy and immune modulation in wound healing」と題して定期刊行物「Journal of Controlled Release」に発表した。武漢大学薬学部2023級博士研究姜鵬氏を論文著者、黎威教授を論文通信著者、武漢大学薬学部を論文完成単位とし、以上の研究活動は国家自然科学基金プロジェクトと武漢大学泰康生命医学センターPI経費の支持を得た。

図1に示すように、このパッチは、溶解性基層中にポルフィリン音響感受性剤（TAPPFe）と結合した正電荷を有するラクトフェリンナノ粒子（LFT NP）と、抗炎症剤アルキミン（SPD）を担持したpH応答性尖層とを集積している。感染組織を挿入した後、放出されたLFT NPは負電荷を持つ細菌を効果的に標的化して凝集し、それによって超音波刺激下で協同化学動力学和声動力学療法（CDT／SDT）によって強力なROSを生成する。同時に、酸性創傷の微小環境は尖層の徐々に分解を触発し、制御可能なSPDは免疫調節を行うために放出される。緑膿菌感染マウスの創傷モデルにおいて、LFT/S-MNパッチは細菌担持量を著しく低下させ、炎症を抑制し、コラーゲン沈着と新生血管形成を促進し、創傷閉鎖を加速させた。

図1.感染創傷を治療するLFT/S-MNパッチの構造と治療機序の概略図。（A）2層LFT／S−MNパッチの設計と製造は、正電荷LFT NPsを担持する可溶性基板層とSPDを封入するpH応答性チップ層からなる。（B）感染創面を挿入した後、基底層は迅速に溶解してLFT NPsを放出し、LFT NPsは積極的に負電荷を持つ細菌を標的にし、SDTとCDTと協力してUS下でROSを生成することにより、有効な細菌除去を実現する。同時に、酸性創傷の微小環境は尖層の分解を触発し、炎症調節のためにSPDの持続放出をもたらした。このような共同戦略は細菌の除去、免疫調節、組織再生を促進し、最終的に傷口の癒合を加速させる。

部位特異性と薬物放出の制御を実現するために、順序形成戦略を用いて、LFT/S-MNパッチと呼ばれるpH応答二層MNパッチを製造した。可視化と構造検証のために、2つの蛍光プローブ、ローダミンB標識ウシ血清アルブミン（RhB-BSA）とイソチオシアネート蛍光体（FITC）を、それぞれナノ粒子の先端と基底層（図2 AとB）に搭載した。尖層は紫外誘導ラジカル重合とメタクリル酸キトサン（CSMA）とSPDTAとの間のシッフ塩基架橋により合成され、基底層は18 wt%のポリビニルアルコール（PVA）とスクロース溶液からなり、裏地層は20 wt%のポリスチレン（PS）からなる。エネルギー分散X線エネルギー分光（EDS）分析（図2 C）により、LFT NPsからの鉄元素分布は均一であり、基底層に限られているが、尖層の炭素元素分布は均一であり、明らかな空間分離を示している。得られたLFT/S-MNパッチは、約0.5 cm 2のスパンを持つ10×10 MNアレイからなる（図2 D）。各針は明確な円錐形形態を持ち、高さは約850μmで、明らかな二層構造を持っている（図2 EとF）。力学的試験によると、各針の破断力は約4 N（図2 G）であり、有効な経皮挿入と潜在的な臨床応用を実現するのに十分である。

図2.LFT/S-MNパッチの特徴付け。（A−B）LFT／S−MNパッチの代表的な明場及び蛍光画像は、組み込み成分の構造完全性及び蛍光標識を説明する。（C）エネルギースペクトルはMNs内の元素の分布を確認した。（D）光学画像と（E，F）SEM画像はLFT／S−MNsの形態を示した。黄色点線は、ph応答性尖層と可溶性基層との界面を表す。（G）LFT/S-MNsの力-変位曲線は、その機械的強度が皮膚透過に適していることを示している。

離体豚皮を用いてLFT/S-MNパッチの皮膚透過能力を評価した。適用後、MNsは角質層を突破し、カプセル化された蛍光染料を皮膚に輸送することに成功し、蛍光イメージング表示（図3 A）、組織学的断面確認（図3 B）。蛍光顕微鏡によりLFT NPsの溶出挙動とその後の放出を観察した。図3 Cに示すように、基層は80秒以内にPBS（pH 7.4）に溶解し、LFT NPsのMN基からの迅速な放出を促進する。感染した創傷微小環境が通常酸性であることを考慮して、著者らはMNチップのpH応答挙動をさらに研究した。体外放出の研究により、尖層は軽度酸性条件下（pH 5.6）で徐々に分解し、15日目までほとんど分解し、中性条件下（pH 7.4）で最小分解が発生し（図3 D）、尖層の酸感受性挙動を示した。薬物装填及び送達効率を定量的に測定した（図3 E及びF）。LFTは145.43±2.76μg、SPDは14.96±0.08μgであった。皮膚投与後、LFT経MNs投与量は132.83±2.91μg、SPD経MNs投与量は14.38±0.22μgであり、両薬物の投与効果率はいずれも90%を超えた。また、酸性条件（pH 5.6）におけるSPDの累積放出量は15日目に88.87±3.58%に達し、PBS（pH 7.4）より顕著に高く、MNチップの酸応答放出スペクトルをさらに確認した（図3 G）。

図3.LFT/S-MNパッチの薬物放出評価。（A）LFT／S−MNパッチ移植後のブタのイオン化皮膚の代表的な明視野と蛍光顕微鏡画像。（B）MNパッチ移植後の豚の皮膚組織学的スライス。（C）光学画像は、80秒間にわたるPBS中の下地層の急速な溶解と尖った層の分離を示した。（D）反転蛍光顕微鏡画像は異なるpH条件下（pH 7.4と5.6）で示し、シミュレーション中性と軽度の酸性創傷環境下で、MNは15日以内に分解した。（E）LFT／S−MNパッチLFTのロードと配信の量子化。（F）LFT／S−MNパッチSPDロードと配信の量子化。（G）LFT／S−MNsにおけるSPDの時間依存invitro累積放出曲線。データはmean±SDで表される（n＝3つの独立サンプル）。

著者らはLFT/S-MNパッチの体外抗菌効果を系統的に評価した。図4 Dに示すように、超音波照射（3 MHz、0.97 W/cm 2、50%デューティ比、30 min）におけるLFTの最小抑制濃度（MIC）は128μg/mLである。単独のLFT/S-MNパッチは中程度の抗菌活性を示し、黄色ブドウ球菌に対する抑制率は36.41±0.75%、緑膿菌に対する抑制率は35.87±1.48%（図4 AとE）であった。対照的に、超音波活性化後、LFT/S-MNパッチの細菌抑制率は著しく向上し、それぞれ99.95±0.04%と99.96±0.04%であり（図4 E）、細菌がほとんど失活していることを示している。SYTO 9／PI染色はこれらの結果をさらに検証し、LFT／S−MN US群は主要な赤色蛍光を示し、広範な細菌死を示した（図4 BとF）。走査電子顕微鏡（SEM）は追加の形態学的証拠を提供し、未処理群の細菌は完全で滑らかな膜を維持し、超音波活性化LFT/S-MNに曝露した細菌は明らかな構造破壊と膜破裂を示した（図4 C）。総じて言えば、これらの発見は、超音波活性化後、LFT/S-MNパッチは大量の局所ROSを産生し、それによって病変部位で効果的に細菌を消滅させることができることを実証した。

図4.LFT/S-MNパッチの体外抗菌性能研究。（A）寒天板の代表的な写真は、黄色ブドウ球菌と緑膿菌に対するLFT/S-MNsの抗菌効果を示している。（B）蛍光顕微鏡画像は、異なる処理条件下で黄色ブドウ球菌と緑膿菌がROSによる酸化ストレスを発生することを示した。（C）処理後の細菌形態のSEM画像は、黄色ブドウ球菌と緑膿菌の膜破壊と構造変形を示した。（D）LFTはLFT/S-MNs中の黄色ブドウ球菌の最小抑制濃度（MIC）であり、用量依存性の抗菌活性を示した。赤色矢印は、LFTのMIC値を表す。（E）異なる処理後の細菌活力の定量分析、生／死染色により評価した。（F）生／死実験における対応する緑色蛍光強度（FI）測定結果により、抗菌作用をさらに確認した。データはmean±SD（n＝3つの独立したサンプル）で表示される。** p < 0.01，** p < 0.001，**** p < 0.0001。nsは有意性がないことを表す。

LFT/S-MNパッチの体内治療効果を検証するために、著者らは銅緑膿菌（P. アエルジノサ）マウス皮膚創面感染モデルを構築した（図5 A）。感染マウスを無作為に8群（各群n＝5）に分け、非超音波群（Blank、S−MN、LF／S−MN、LFT／S−MN）と超音波処理群（Blank＋US、S−MN＋US、LF／S−MN＋US、LFT／S−MN＋US）を含む。超音波方式は3 MHz毎日照射、0.97 W/cm 2、50%デューティサイクル、30分、3日間連続を含む。治療後0、1、3、5、9日目に創傷の進行を写真撮影により監視した（図5 B）。1日目、LFT/S-MN+US群の膿性滲出は明らかに減少し、CDTとSDTの併用抗菌作用を反映した。対照的に、非超音波グループはより広範な膿毒と炎症を示した。3日目、超音波投与が完了した後、創傷床サンプルを集めて細菌培養を行い、残留細菌負荷を評価した（図5 E）。平板計数により、LFT/S-MN+US群のコロニー形成が最も少なく、体内の抗菌活性がより強いことが示された（図5 F）。9日目までに、LFT/S-MN+US処理したマウスの創傷癒合率が高く、組織再生が明らかになった（図5 C）。全治療過程において、体重モニタリングは各グループ間に明らかな変動がないことを示し（図5 D）、MNパッチは良好な全身生体適合性を有することを表明した。以上より、これらの結果は、LFT/S-MNと超音波結合により、細菌感染を効果的に除去し、体内創傷癒合を顕著に加速できることを示した。

図5.LFT/S-MN貼付剤の体内抗菌効果と創傷治癒性能。（A）緑膿菌感染マウスの創傷モデルの概略図とMNパッチを用いたUS刺激の付加または非付加の治療戦略。（B）処置後0、1、3、5、9日目の創傷部位の代表的な写真。黒の仮想コイルは初期創傷境界を表す。（C）各治療群の創傷癒合の経時的定量分析（n＝5）。（D）治療中のマウス体重モニタリング（n＝5）。（E）各群の3日目創傷床培養細菌コロニーの寒天板写真。（F）コロニー形成単位（CFU）分析に基づく細菌活力の定量化（n＝3）。データはmean±SDで表される。*** p < 0.001，**** p < 0.0001。nsは有意性がないことを表す。

結論：この研究はpH応答の二層マイクロニードルパッチ（LFT/S-MN）の開発に成功し、超音波活性化の協同抗菌療法（CDT/SDT）と酸性マイクロ環境に触発される免疫調節を統合することにより、感染傷口に対する効率的な治療を実現した。このパッチは標的細菌のLFT NPsを迅速に放出するだけでなく、超音波下で細菌と生体膜を除去するために大量のROSを生成し、創傷酸性条件下でSPDを持続的に放出し、マクロファージ分極を調節し、過度の炎症を抑制することができる。体内実験により、この戦略は傷口の閉鎖を著しく加速させ、組織の再生を促進し、優れた生物安全性を有することが確認された。この仕事は非抗生物質依存の感染創傷治療と組織再生に臨床転化の潜在力を持つ新しい策略を提供した。