一、全自動PCR計操作前準備

試薬と消耗品の準備

試薬：DNAテンプレート、特異的プライマー（順方向と逆方向）、dNTPs（4種類のデオキシリボヌクレオチド）、高温耐性DNAポリメラーゼ（例えばTaq酵素）、緩衝液及びMg²イオン溶液を含む。すべての試薬は完全に溶解して混合し、濃度誤差を避ける必要がある。

消耗品：使い捨て無菌PCR管または96ウェルプレートを使用し、密封性を確保し、交差汚染を防止する。

パーティション操作：試薬準備エリア（超清浄作業台または生物安全キャビネット）でシステムの調製を完了し、操作時に手袋を着用し、会話を避け、エアロゾル汚染を減らす。

計器検査

PCR計が水平堅牢プラットフォーム上に置かれ、電源電圧が整合し、接地が良好であることを確認した。

サンプル槽が清潔であるかどうかを検査し、残留物が温度伝導に影響を与えないようにする。

定期的に石鹸水でサンプル槽を洗浄し、強アルカリ、高濃度アルコールまたは有機溶媒の使用を禁止する。

二、反応系の調製

こんごうしやく

DNAテンプレート、プライマー、dNTPs、DNAポリメラーゼ、緩衝液及びMg²溶液を比例して無菌遠心管に加え、適量の二重蒸水を加えて最終体積（推奨15 ~ 50μL）に定容した。

重要なパラメータ：

DNAテンプレートの品質：分解や抑制剤汚染を避ける、そうでなければ増幅効率に影響する。

プライマー設計：特異性を確保し、二量体または自己相補構造を回避し、アニール温度はプライマーTm値と整合する必要がある。

Mg²の濃度：高すぎても低すぎても酵素活性を抑制するので、試薬説明書に従って調整する必要がある。

ぶんぱいシステム

混合液を速やかにPCR管に分注し、管蓋を締めたり専用膜を覆ったりして、短時間遠心（1000-2000 rpm、1分間）液体を管底に沈めた。

三、PCR計プログラムの設置

温度プログラムパラメータ

初期変性：94〜98℃、20〜30秒、DNA二重鎖を完全に分離した。

循環変性：94〜98℃、20〜30秒、単鎖状態を維持する。

アニール：50〜65℃、20〜40秒、プライマーとテンプレートとの特異的な結合（アニール温度は勾配PCRにより最適化する必要がある）。

延長：72℃、1分/kb DNA断片、Taq酵素合成新鎖。

サイクル数：20〜40回、目標フラグメントの存在度に応じて調整する。

最終延長：72℃、5〜10分、すべての断片が完全に延びることを確保する。

保存温度：16℃、2分間（圧縮機の過度な消耗を避け、4℃の無期限保存を禁止）。

高度な機能設定

温度勾配：アニール工程で温度勾配（例えば50〜65℃）を設定し、同時に複数のアニール温度をテストし、実験条件を最適化する。

昇温速度（Ramp Rate）：昇温・降温速度（例えば3℃/s）を調整し、反応時間を短縮する。

循環増分（Increment）：各循環後の温度または時間の増加（例えば、循環ごとに0.1℃）、Touchdown PCRなどの特殊実験に適用する。

プログラムの保存と実行

プログラム名を入力して保存し、PCRチューブをサンプル槽に入れ、ヒートカバーを閉じて締め付ける。

プログラムを起動し、実行中に画面を通じてリアルタイムに温度と時間を監視することができ、一時停止、ステップスキップ、プログラムの終了をサポートする。

四、実験後処理

せいぶつぶんせき

反応終了直後にPCR管を取り出し、アガロースゲル電気泳動または蛍光検査（SYBR Greenなど）により生成物の大きさと濃度を分析した。

蛍光標識法を使用する場合は、励起波長、利得値などの計器パラメータが試薬と整合することを確保し、背景信号の干渉を避ける必要がある。

けいきほしゅ

機器を閉じる前に、加熱モジュールを室温まで自然冷却し、熱応力損傷を防止する。

温度センサを定期的に較正し、温度の正確性を確保する（例えば、標準融点較正剤を使用する）。

サンプル槽とヒートカバーを清掃し、シールリングが老化しているかどうかを検査し、損失部品を適時に交換する。

五、全自動PCR計注意事項

おせんぼうしせいぎょ

実験の全過程は「核酸なし」の原則に従い、専用ピペット、ガンヘッド、作業服を使用し、交差汚染を回避した。

陰性対照（テンプレートなし）と陽性対照を設立し、実験システムの信頼性を監視する。

セキュリティ操作

PCR器の運転時に熱蓋を開けて、高温火傷やサンプルの蒸発を防止することを避ける。

腐食性液体洗浄機器の使用を禁止し、電子部品の損傷を防止する。

障害の検出

増幅産物なし：テンプレートの品質、プライマー設計またはプログラムパラメータ（アニール温度が高すぎるなど）を検査する。

非特異性ストリップ：アニーリング温度を最適化するか、延長時間を増加させ、二量体形成を減少させる。

温度変動：エンジニアに連絡して計器を校正し、温度均一性が標準（例えば±0.2℃）に合うことを確保する。