禹重科技-業界応用

液体クロマトグラフィー（HPLC）は分析実験室でよく使われる試験機器の一つであり、その応用はますます広くなっている。このような機器の使用過程では、さまざまな問題が発生し、測定データの正確性と機器の正常な動作に直接影響を与えることは避けられない。操作者は故障の原因を知ることができれば、これらの故障の予防と排除方法を明らかにすることができ、計器を正しく使用し、計器の性能を最大限に発揮することができる。今日は、液体クロマトグラフィーを使用する上で注意しなければならないいくつかの問題を以下の点から共有します。

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一、試験管を使用する問題

1、試験管の清潔問題。液体クロマトグラフィー分析法は非常に敏感な分析方法であり、不潔な試験管を使用することにより、試験結果の正確性に影響を与える。例えば、メタノールを溶媒として試料を溶解する際、使用する小試験管はゴム栓で蓋をしているため、試料を注入するたびに、保持時間が固定された干渉ピークが存在し、その後、この干渉ピークはメタノールがゴム栓を浸漬して溶解した成分によって発生し、ガラス試験管を交換した後、干渉ピークが除去されることが確認された。

2、プラスチック試験管の溶解問題。近年、使い捨てプラスチック試験管は試験者に非常に便利であるが、使用中には必ず有機溶媒の試験管への溶解現象に注意しなければならない。このような試験管を用いてサンプルを抽出する際には、lvfangなどの有機溶媒によって管壁に溶解現象があり、これらの溶解された物質は検出器に信号を発生させ、サンプルの測定を妨害することもある。この時、同じ実験条件で先に試験してみて、被抽出物が含まれていない場合、抽出液が検出器に干渉信号を発生できるかどうかを見て、もし干渉信号が存在するならば、耐有機溶剤のガラス試験管を交換するしかない。

3、試験管壁への被測定サンプルの吸着問題。この問題も注意を喚起すべきで、さもなくば試験結果の正確性にも影響し、治療薬モニタリング（Therapeutic Drug Monitoring、TDM）の中には、アミチリン、プロピリミジンなどの測定薬がガラス試験管の管壁に吸着しやすいものもあるので、操作中にポリプロピレン管を採用することが好ましく、抽出中の吸着現象の発生を防止するために、抽出剤として0.5%のジアミンすでにアルカン液を採用することができ、吸着を効果的に防止することができる。

二、操作注入弁の問題

現在、分析型液体クロマトグラフィー装置で一般的に使用されている注入弁は7725型注入弁であり、その内部の六方弁構造は注入操作を非常に便利にしているが、使用が適切でなければ、問題をもたらすこともある。例えば、液体クロマトグラフィーの試験過程において、異常クロマトグラフィーピークの発生や再現性の悪い問題があることがある。これは主に操作方法の不適切さに起因しており、このような問題を解決するには、以下のいくつかの点から着手する必要がある。

1、注入量の制御。注入バルブを用いて注入する場合、バルブ内の試料リングは定量的であり、（一般的な分析型注入バルブの試料リング体積は20 ulである）、注入時に、注入バルブ内に注入された試料溶液は試料リングの管路中で径方向の速度勾配がある（すなわち管軸において管壁における液流速度より速い）。したがって、試料リングに試料溶液を充填し、それによって注入バルブを用いて正確に定量するには、試料リングの体積の2倍以上の注入量が必要である。注入器を用いて注入量を制御する場合、zuiが大きいのはサンプルリングの体積の1/2量しか注入できず、これによって一部のサンプルがオーバーフロー管からあふれて定量分析の誤差を招くことを防ぐことができる。

2、注入弁の清掃問題。サンプルリングに前回注入時のサンプルの残留があれば、必ず次回注入されたサンプルを汚染し、この現象の発生を防止するために、a.注入バルブには2つの位置、INJECTとLOADがある。まずLOAD位置では、注入器を用いて移動相をサンプリングバルブ内に注入して数回洗浄し、1回の使用量は約40 ul、b.その後、注入バルブプレートをINJECT位置に手を引くと、再び移動相を用いて数回洗浄し、1回の使用量はまだ40 ul、c.zuiの後、サンプルを注入バルブに注入した。

上記の手順に従えば、注入バルブによる汚染を回避し、干渉ピークを除去し、分析結果の精度を高めることができる。

3、注入バルブリリーフ管の閉塞。場合によっては、注入バルブのリリーフチューブに閉塞現象が発生し、注入バルブ内にサンプルを注入する際に、注射針が押動できないことがある。この障害は、オーバーフローチューブの詰まりによるものです。閉塞の原因の大半は、溶解試料の流動相が塩溶液を用いているのに対し、その中の塩がオーバーフロー管の排気ポートで結晶化していることによるものである。その際、小さなビーカーに少量の蒸留水を入れて溢流管口に少し浸漬することで、ポートの塩の結晶が溶解され、トラブルシューティングされる。注入が完了するたびに、蒸留水を用いてオーバーフロー管に繰り返し洗浄した塩分をすべて流すことができれば、この故障の発生を回避することができる。

三、流動相（MOBLLE PHASE）の問題

メタノール及びアセトニトリルは、液体クロマトグラフィー分析法において流動相を調製するためにしばしば用いられる。液体クロマトグラフィーで一般的に使用される試薬は、クロマトグラフィー純試薬などの高レベルの試薬である。要求があまり厳しくない場合、優等純は純粋な試薬を分析することさえできる。液体クロマトグラフィー分析法でよく使われるのは紫外線検出器であるため、ベースラインノイズの低減と分析感度の向上から、紫外線吸収が小さく不純物含有量が少ないクロマトグラフィー純試薬を使用すべきである。

1、流動相の濾過。調製された流動相は使用前に必ず0.5 um孔径の微孔ろ過膜でろ過しなければならない。これは、溶液には肉眼では発見しにくい微小粒子が多く含まれており、それを濾過除去しないと、ポンプポート、柱頭上のフィルタが詰まり、これにより移動相の正常な通路が詰まり、カラムの抵抗が増加し、カラム圧が上昇し、カラム効果が低下するためである。このような場合は、濾過された流動相を交換し、目詰まりフィルターを取り外して20%の硝酸水溶液に浸漬し、超音波洗浄機で20分間洗浄して、フィルター上の目詰まりを除去します。

2、移動相の脱気。移動相は使用前に脱気して、できるだけ移動相に溶解したガスを除去しなければならない。そうしないと、これらのガスはカラムフィラーの性能を低下させ、検出器の信号に大きな干渉を与えることができる。脱気には、超音波脱気、真空脱気、窒素脱気など、さまざまな方法がある。真空脱気法と窒素ガス流脱気法は現在zuiでよく使われている脱気法である。水とメタノールを混合すると大量の気泡が発生し、脱気せずに使用すると、気泡はカラムと検出器に入り、分析作業の正常な進行に影響を与える。

四、カラムの使用とメンテナンス

カラムは液体クロマトグラフィー装置のzuiの主要な部品であり、被測定物質がよく分離され測定されるかどうか、カラムの性能は決定的な役割を果たしている。そのため、日常の仕事の中で、特にカラムの正確な使用とメンテナンスに注意して、カラムの使用寿命を延長する必要があります。

1、前柱と保護柱を使用する。プレカラム（pre-column）はポンプと注入器の間に設置され、カラム中の移動相に*のバランスを提供し、カラムフィラーに破壊作用を与える成分や汚染物質がカラムに入るのを防止します。保護カラム（guard column）は、カラムにしっかり吸着できる成分がカラムに入るのを防ぐことができ、保護カラムはカラムのフィラーと同じでなければならない。予備カラムと保護カラムは頻繁に交換することができ、カラムを頻繁に交換する必要がなくなり、カラムの寿命が長くなります。

2、ガスがカラムに入らないようにする。ゲルカラムのようなカラムの中には、気泡の進入を許可しないものもあります。そうしないと、カラム効果が低下し、除去が困難な微小なガス室が形成されます。そのため、気泡がカラムに入らないようにするためには、必ず脱気された流動相を使用し、厳密には以下の手順に従ってカラムを取り付ける必要があります。a.下のカラム入口のシールネジを取り外し、溶剤が滲出しているかどうかを観察する、b.溶媒の滲出があれば、気泡の進入を避けるためにカラムを管路に接続することができ、c.無溶媒が滲出した場合、カラムのこの端に空気が入っていることを示し、その場合、カラムの出口端をサンプリングバルブに接続し、カラム内の空気を排除するために、移動相を逆方向に洗浄することができる。0.2 ml/minの小流量でカラムを流し、溶媒の流速が速すぎたり、圧力が急に上昇したりするとカラム性能が低下します。d.流出した溶媒に気泡が含まれていない場合は、カラム内のガスが排出されたことを示し、カラムを正しい方向に接続すると、気泡がカラム内に入らなくなります。

3、カラムの洗浄。測定された物質や不純物がカラムに留まらないようにするためには、サンプル分析作業が完了するたびに、カラムをタイムリーに洗浄する必要があります。まず、測定された試料の溶出能力の高い溶剤を用いてカラムを溶出し、分析作業においてよく用いられる逆相クロマトグラフィー分析法を例にして、先に流出した物質は極性の大きい物質であるため、この時に100%のメタノールを用いたり、イソプロピル純、テトラヒドロフランなどの極性のやや弱い溶剤を用いてカラム内に吸着した極性の小さい物質を溶出したりして、溶出液の使用量は一般的にカラム体積の20倍であればよい。移動相が緩衝液である場合は、カラム内の塩を洗い流すために蒸留水ですすぎ、適切な溶媒ですすぎます。

ゲル濾過クロマトグラフィー（Gel Filtration Chromatography）に使用されるゲルカラムは、通常、緩衝液を用いて移動相として用いられ、使用後はもちろん蒸留水で洗い流される。連続操作の場合は、バッファ溶液をカラム内に一晩おきに置くことができますが、バッファ塩の析出を防ぐために小さな流速（<0.5 ml/min）を維持し、流動相にハロゲン化物が含まれている場合は、一晩おきにしても、カラムの腐食を防ぐために蒸留水でカラムを洗浄する必要があります。

4、カラムの保管。カラムを一時的に使用しない場合は、次の点に注意して保管してください。

a.数日以内の短期放置は、まず溶媒でカラムを洗い流し（ゲルカラムの場合は蒸留水で洗い流す）、カラムの両端をシールネジで密封すればよい。

b.カラムを長期間使用しない場合、上述の方法だけで処理してはいけない。この場合、カラム使用説明書に記載されている溶剤を使用してカラムを満たすべきで、反転カラムは一般的にメタノールを使用し、正相カラムは正の既知のアルカンまたはヘプタンを使用することができ、ゲルカラムは水を使用することができない。カラム内に微生物の成長があればカラム効果が低下するため、0.05%NaNs水溶液（防腐剤）を使用してカラムを洗浄し、カラムを密封する。カラムを長期間放置する場合は、溶媒の揮発によるカラムフィラーの乾燥収縮現象を防止するために、カラムの両端を厳重にシールしなければならない。

c.カラムは室温で保存し、0℃以下の環境に置くとカラム内が凍結し、カラム効果の低下を招く。

五、クロマトグラフィーピークの二峰問題

長期使用後のカラムは、不純物が入ってくると、カラムの入り口にある固定相「プレート」を形成し、移動相による高圧作用の下で、カラムヘッドの陥没を形成し、分析されたサンプル成分の正常なクロマトグラフィーピークが二重ピークになり、その場合は下記の方法でカラムを修復することができる。まず、柱頭の締め付けナットをねじ込むと、柱頭内の固定相が圧縮されており、ひどい場合は10 mm以上縮むことができる。この場合、流動相テーブル積層板の結び目が黄色くなった部分を針先でほじくり、この陥没領域を同じ固定相で平らにし、圧密し、さらにカラムの締め付けネジを締めて、修復作業は終了します。修復されたカラムを使用してサンプルを作成すると、カラムピークは正常に戻ります。

以上、クロマトグラフの正しい使用とトラブルシューティング方法をいくつかの方面から紹介した。日常業務において、これらの事項に真剣に対応し、問題があれば速やかに解決することができれば、機器の正常な使用期限を大幅に延長し、機器の性能をzuiに最大限に発揮させることができる。