実験方法の原理

細胞は対数晩期まで成長し、培地で高濃度細胞懸濁液を調製し、細胞保護剤を添加し、等分を凍結保存管に移し、ゆっくりと凍結した。

細胞凍結保存時に培地に保護剤、すなわち最終濃度5%・15%のグリセリンまたはジメチルスルホキシド（DMSO）を添加すると、溶液の氷点を低下させることができ、また緩慢凍結条件下では細胞内の水分が透過し、氷晶形成を減少させ、細胞損傷を回避することができる。「徐凍速融」を用いた方法は細胞の生存をよりよく保証することができる。標準冷凍速度は-1〜-2℃/minで始まり、温度が-25℃未満の場合は加速でき、-80℃になったら液体窒素内に直接投入することができる（-196℃）。

じっけんざいりょう

さいぼう

試薬、キット

トリプシンBSS DMSO

ストロー遠心管ガラスアンプルアルコールランプコードガーゼポケットエナメル缶

実験手順

1.肉眼及び顕微鏡観察により、細胞が冷凍基準を満たすことを確保する。

2.細胞を対数成長末期まで成長させ、壁貼り細胞であれば、トリプシンで消化し、細胞技数を行う。懸濁増殖細胞であれば、細胞計数を行い遠心分離する。

3.懸濁細胞の濃度は：2×106個~ 2×107個細胞/ml。

4.以下のいずれかの細胞保護剤を成長培地に添加し、凍結保存液を調製する：

（a）ジメチルスルホキシド（DMSO）を10〜20%添加するか、（b）グリセリンを20〜30%添加する。

5.凍結保存液を用いて細胞懸濁液を1：1の割合で細胞度濃さが約1×106 ~ 1×107/mlに希釈し、この時DMSOの濃度は5%~ 10%（またはグリセリン濃度が10 ~ 15%）であった。DMSOを使用する場合、室温で30 min操作することは無害であり、グリセリンを使用する場合、細胞に有益である。

6.細胞懸濁液を予め標識された凍結貯蔵管に分注し、蓋をし、締め付け、密封し、螺旋のねじれ変形を避けるために、きつくなりすぎないように注意する。

7.凍結貯蔵管をアルミニウムストリップに挟んで、貯蔵筒に入れたり、引き出し貯蔵器に緩く並べたりします。

8.凍結貯蔵管を上記方法の1つにより1℃／minの速度で凍結した。断熱保温の方法を用いて、凍結貯蔵管を-70℃に到達させ、最初の温度が20℃であれば、4 ~ 6 h必要であるが、-70℃で一晩過ごすのが良い。

9.凍結貯蔵管の温度が−70℃以下に達した場合、−70℃または凍結速度を制御できる冷凍キャビネットから移動する前に、凍結記録を検査し、液体窒素タンクに凍結貯蔵管を保管する適切な位置を決定する。

10.液体窒素中に浸漬させないために、凍結貯蔵管を液体窒素冷凍タンクに移し、油凍結貯蔵管を入れたアルミニウム条と紙管を予め定められた貯蔵筒に入れたり、個別の凍結貯蔵管を予め定められた引き出しに入れたりする。凍結保存管は10℃/minほどの速度で昇温し、温度が-50℃を超えると細胞が急速に悪化するため、この手順は迅速に（＜2 min）でなければならない。

注意事項

1.ジメチルスルホキシドは、皮膚およびゴム手袋を含む多くの合成または天然の膜を貫通することができる。

2.凍結貯蔵管を液体窒素に入れる場合、保護性手袋とマスクを使用しなければならない。

その他1.細胞の最大生存率を維持するために、一般的に徐凍保存融解の方法を採用する。

2.凍結保存物は液体窒素面に近いほど温度が低くなる。標準的な低凍結速度は−1℃〜12℃／分であり、温度が−25℃に低下すると、低下速度は−5〜−10℃／分に増加し、−100℃になると急速に液体窒素中に凍結することができる。そのため、凍結保存物が液体窒素中に降下する速度を適切に把握し、速すぎると細胞内の水分の透過に影響し、遅すぎると氷晶の形成を促進する。

3.初回凍結保存者は下降凍結保存する時、まず細い木の棒をタンクに入れて液面位置を探知し、それから温度計と凍結保存物を並行する方法を用いて、下降凍結保存物の速度、凍結保存物と液体窒素液面距離と温度の三者関係を観測し、以上の各パラメータと凍結保存技術をマスターして熟練した後、下降時間と下降距離だけで理想的な凍結保存効果を得ることができる。

4.各種細胞の凍結保存速度に対する要求も異なる、上皮細胞と線維芽細胞は耐性が大きい可能性があり、骨髄幹細胞−2〜−3℃／分が適切である、胚細胞の耐性は小さく、速すぎるべきではない。

5.どの保護剤を使用するのが適切で使用量が多いかは、細胞によって異なり、初代培養細胞はDMSOを使用するのがよく、一般的な細胞はグリセリンを使用することができる、使用量は小さいほうがいい。ヒト皮膚上皮細胞は20〜30%グリセリン中に貯蔵されていることが好ましいと考えられている。

6.原則として、細胞は液体窒素中で長年保存することができるが、適切なために、1年凍結保存した後、再び回復して培養し、その後、凍結保存を続けるべきである。