蛍光定量PCR（qPCR）計は分子生物学研究、臨床診断（例えば新型コロナウイルス検査）などの分野の核心設備であり、その正確性は実験結果の信頼性に直接影響する。校正（校正）はqPCR計の性能安定を確保する重要なステップであり、定期的に温度制御システム（温度制御精度）と光学系（蛍光信号検出）に対して系統的な検証と調整を行う必要がある。
一、修正の核心目標
qPCR計の補正は、以下の重要な性能指標が要求に合致することを確保することを目的としている：
温度制御システム：温度表示誤差（設定温度と実際の温度の偏差）、温度均一度（反応孔間温度差）、温度変動度（温度の時間による変化）、温度最大オーバーシュート量（昇温・降温過程における設定値を超える幅）、平均昇降温速度（昇温・降温の速度）。
光学系：蛍光強度精密度（同一細孔蛍光信号の一致性）、閾値サイクル数（Ct値）精密度（異なる細孔Ct値の一致性）、溶解温度（Tm値）ドリフト（蛍光強度が半分低下した場合の温度偏差）、蛍光線形相関係数（蛍光強度と核酸濃度の線形関係）。
二、校正前の準備
1.環境条件
温度：15～30℃（温度変動が校正結果に影響することを避ける）、
相対湿度：20～85%RH（機器の湿気防止）、
電源：定電圧（UPSの使用を推奨）、パワーダウンが校正プロセスに影響を与えないようにする。
2.設備と材料
標準物質：有証標準物質（例えばプラスミドDNA、リボヌクレオチド標準物質）を使用し、その特性量値（コピー数≧10µcopies/μL）及び相対拡張不確定度（≦5%）はJJF（津）04-2020要求に適合する必要がある、
校正装置：光学シミュレータ（集積温度センサと発光光発生器、温度測定範囲0-120℃、最大許容誤差±0.1℃、発光光波長360-780 nm、相対光放射強度調整可能）、多チャンネル温度検査器（例えばJDPC-96、対応孔間温度差測定用）、
消耗品：専用校正板（例えばAB 7500 ROI校正板、背景校正板）、ピペット（2μL、10μLなど、計量検定合格が必要）、粉なし手袋（汚染防止校正板）。
三、校正の主な流れ
qPCR計の校正フローは厳格にJJF（津）04-2020「リアルタイム蛍光定量PCR計校正規範」に従う必要があり、主に温度系校正と光学系校正の2つの部分を含み、以下にAB 7500シリーズ計器を例に具体的なステップを説明する：
（一）温度システム校正
温度はqPCR反応の核心パラメータであり、DNA増幅効率に直接影響する。温度システムの校正には光学シミュレータ（反応管の代わりに）を使用し、実際の反応中の温度変化をシミュレーションし、機器の温度制御性能を検証する必要がある。
1.校正前準備
光学シミュレータとqPCR計を接続し、下方温度センサと上方蛍光発光光源と計器の均熱ブロックの接触が良好であることを確保する。
光学シミュレータの下に熱伝導油を塗布し、熱伝導を強化する。
計器ソフトウェアを開き、「校正」モジュールを選択し、「温度校正」プログラムに入る。
2.キャリブレーションプログラム
予熱：機器温度を23℃に設定し、予熱プログラム（約10分）を実行し、機器を安定状態にする、
温度点の設定：9つの温度点（30℃、50℃、60℃、70℃、90℃、95℃など）を選択し、各温度点は2分間（温度表示誤差、均一度、波動度を測定するため）継続する、
昇温・降温過程：50℃から90℃に昇温（平均昇温速度を測定）、更に90℃から50℃に降温（平均降温速度を測定）、
データ収集：計器は温度点ごとの設定温度（Ts）、実際の温度平均値（T₁）、温度変動値（T _ v）、最大オーバーシュート値（T _ os）を自動的に記録する。
3.結果計算
温度表示誤差：△T＝Ts−T₁（要求≦±0.5℃）、
温度均一性：△Tu=T _ umax-T _ umin（T _ umaxはすべての孔温度の最大値、T _ uminは最小値、要求は≦1.0℃）、
温度変動度：△T _ v=±（T _ max-T _ min）/2（T _ maxは単一孔温度最大値、T _ minは最小値、要求≤0.2℃）、
温度最大オーバーパンチ量：△T _ os=Tosmax-Ts（Tosmaxはすべての穴のオーバーパンチ値の最大値であり、≦3.0℃）、
平均昇温速度：v _ up=（TB-TA）/tut（TBは90℃温度点平均値、TAは50℃温度点平均値、tutは昇温時間、要求≧4℃/秒）、
平均降温速度：v _ down=（TB-TA）/tdo（tdoは降温時間、要求≧3℃/秒）。
（二）光学系校正
光学系は蛍光信号の検出を担当し、その正確性はCt値と核酸濃度の定量結果に直接影響する。光学系のキャリブレーションには、専用キャリブレーションボード（AB 7500 ROIキャリブレーションボードなど）を使用して、蛍光検出器の感度と信号の一致性を調整する必要があります。
1.背景キャリブレーション
目的：機器の底部蛍光（例えば電子信号、プラスチック消耗品汚染）の干渉を除去する、
手順：
（1）背景校正板を取り出す（室温で5分間放置し、凝縮水を避ける必要がある）、
（2）校正板を計器に入れ、「背景校正」プログラムを実行する（約30分）、
（3）ソフトウェアは背景蛍光信号を自動的に記録し、背景補正ファイルを生成する（後続の実験で自動的に差し引く）。
2.ROI（関心領域）キャリブレーション
目的：反応板上の孔位を計器検出器にマッピングし、各孔の蛍光信号の正確な収集を確保する、
手順：
（1）ROI校正板を取り出す（標準板または快速板、5秒間渦回し、2分間遠心分離する必要がある）、
（2）校正板を計器に入れ、「ROI校正」プログラムを実行する、
（3）ソフトウェアは各フィルターの画像を自動的に撮影し、ROIマスクを生成する（各穴の周囲に緑色の円を表示し、校正に成功したことを示す）、
（4）画像が過飽和（孔内蛍光が強すぎる）場合、露光時間を調整し（例えば2048から1024に減少）、画像を再収集する必要がある。
3.光学キャリブレーション
目的：光学系の物理効果（フィルターのスペクトル応答など）を補償し、蛍光信号の正確性を確保する、
手順：
（1）「光学キャリブレーション」プログラムを選択し、ROIキャリブレーションファイルをロードする、
（2）プログラム（約10分）を実行し、ソフトウェアは蛍光信号のスペクトル特徴を自動的に分析し、光学校正ファイルを生成する。
4.染料較正
目的：異なる染料（例えばFAM、VIC、ROX）の蛍光信号の正確性を検証し、多染料実験の信頼性を確保する、
手順：
（1）染料較正板（CY 3、CY 5、FAMなどの多種の蛍光染料を含む）を取り出す、
（2）校正板を計器に入れ、「染料校正」プログラムを実行する、
（3）ソフトウェアは各染料の蛍光スペクトルを自動的に収集し、染料補正ファイルを生成する（後続の実験で染料信号を自動的に識別する）。
（三）結果記録と証明書
キャリブレーションが完了すると、次の内容を含むCNAS認証のキャリブレーション証明書を発行する必要があります。
（1）機器基本情報（型番、シリアル番号、メーカー）、
（2）環境条件（温度、湿度、時間）を校正する。
（3）校正結果（温度表示誤差、均一度、光学系精密度など）、
（4）校正者と審査者の署名、
（5）較正機構資格（CNAS認可番号）。
四、校正の注意事項
1.キャリブレーションサイクル
12ヶ月ごとに全面的な校正を行うことを提案する（JJF（津）04-2020要求に符合する）、
高使用頻度（例えば1日10回以上運転）または重要な応用（例えば臨床診断）では、6ヶ月に1回に短縮することができ、
機器の移転、修理、または加熱ブロック、検出器などの重要な部品を交換した後、再較正する必要があります。
2.プロサポート
校正はメーカーエンジニアまたは資質を備えた第三者機関（例えば天津市計量監督検査科学研究院）が実行し、SOP（標準操作手順）に適合することを確保する必要がある、
校正結果に影響を与えないように、非専門家が機器のパラメータ（例えば温度設定、光学フィルター）を自分で調整することを禁止する。
3.校正後の検証
校正完了後、標準物質検証実験（例えばプラスミドDNA標準物質）を実行し、Ct値の繰り返し性（変異係数≦3%）と線形相関係数（R²≧0.99）を測定し、校正効果を確保する必要がある、
検証結果が要求に合わない場合は、再校正するか、メーカーに連絡して修理する必要があります。
五、よくある問題と解決
1.温度均一性が要求に合わない
原因：均熱ブロック汚染（残留PCR製品など）、温度センサーの老化、
解決：均熱ブロックを清掃し（無水エタノールで拭く）、温度センサーを交換する。
2.蛍光信号強度が低い
原因：ROIキャリブレーション失敗（穴位置マッピングエラー）、背景蛍光が高すぎる、
解決：ROIキャリブレーションをやり直し、背景キャリブレーションを実行する（背景キャリブレーションボードを交換する）。
3.Ct値の変異が大きい
原因：温度変動度が基準を超え（例えば加熱ブロックが不安定）、蛍光検出器の感度が低下した、
解決：加熱ブロックの温度安定性を検査し（多チャンネル温度検査器で測定）、蛍光検出器を交換する。
六、まとめ
蛍光定量PCR計の校正は実験データの正確で信頼性を確保する重要なステップであり、厳格に業界標準（例えばJJF 1527-2015、JJF（津）04-2020）に従い、定期的に温度制御システムと光学システムを校正する必要がある。校正過程では環境条件、専門的な支持と結果検証に注意し、計器の性能が実験要求に合致することを確保しなければならない。規範的な補正プロセスを通じて、実験誤差を効果的に減少させ、qPCR結果の正確性と重複性を高めることができる。