オリンパス蛍光顕微鏡の解剖図

2018/7/26 7：52：45リリース者：admin

マクロサンプルの特徴に基づく他の光学顕微鏡位相勾配、光吸収、複屈折などのモードと比較して、蛍光顕微鏡は蛍光発光の特性のみに基づいて単一分子種の分布を結像することができる。したがって、蛍光顕微鏡を用いて、特定の蛍光団で標識された細胞内成分の正確な位置、およびそれらに関連する拡散係数、輸送特性、および他の生物分子の相互作用。さらに、局所環境変数に対する蛍光の顕著な応答は、生細胞及び組織中のpH、粘度、屈折率、イオン濃度、膜電位及び溶媒極性の研究を可能にする。

初期の蛍光顕微鏡配置は古典的な明場または暗場透過（とうかこう）光学系フィルターを通過した励起光をサンプル平面に集光する。蛍光発光及び大量の励起照射を対物レンズにより収集し、第2のフィルタにより接眼絞りに投射して中間画像を形成する。励起光の強度は通常蛍光発光より数桁大きいので、これらの早期透過光顕微鏡におけるサンプルビューは通常コントラストが非常に低く、散乱励起照射に満ちた背景に重畳されている。高開口数油浸漬暗視野集光器を用いて高傾斜方位角で試料を照射することは、ほとんどの背景ノイズを除去するのに役立つが、低開口数対物レンズを除いては十分な照明を提供していない。画像の解像度が悪く、輝度が非常に低い。

蛍光顕微鏡と入射光（反射光または落下）照明は、不透明な冶金サンプル中の蛍光発光を観察するために1920年代後半に開発された。彼らの明場対応物と同様に、これらの反射光蛍光器具は半反射式ビームスプリッタを採用し、その総効率は約25%（鏡を通過するたびに50%の照度を失う）である。しかしながら、反射光蛍光顕微鏡は、集光器としての高開口数対物レンズの利点を有し、同様の開口数で動作する透過光顕微鏡よりも有意に高いレベルの画像を生成することができる。さらに、高開口数での反射対物レンズの迷励起光はわずか数パーセントに減少した。反射光顕微鏡における対物レンズの二重作用もアライメントタスクを著しく簡略化する。入射した励起光と観察された蛍光発光が顕微鏡光学系を通過する同じ経路に従うように、対物レンズのみを試料に焦点を合わせて照明場と視野を確立した。

1930年代半ばに小型水銀蒸気とキセノンアーク放電ランプが開発された時、照明光源の技術進歩は反射光蛍光（少なくとも金相学）の転換を推進した。この間、着色ガラスとゼラチンフィルタもより複雑になり、青と緑の可視光によって励起された蛍光染料をハロゲンタングステンランプを用いて適用することができるようになった。反射防止コーティングと改良されたガラス処方は1940年代に対物レンズ設計の重大な改良をもたらしたが、入射光蛍光顕微鏡の発展に対する根本的な貢献は、1948年にロシアの光学科学者Eugeny Brumbergによって2色分光鏡（2色鏡とも呼ばれる）の導入であった。この革新は、反射光顕微鏡に通常のハーフミラーを使用することに固有の光損失の問題を克服した。反射光蛍光顕微鏡は、最初はJohan S.Ploemによって1960年代後半に広く商業化され、Wild-Leitz Ploem Opakの開発に重要な役割を果たした。その中には複数の交換可能な光学モジュールが含まれ、各種蛍光顕微鏡フィルタの組み合わせが組み込まれている。

落射蛍光顕微鏡の基本戦略

反射光蛍光顕微鏡のほとんどは、インコヒーレント光源の広視野研究のための現在の選択方法であり、レーザー走査共焦点と多光子機器で行われているものである。この一般的な蛍光顕微鏡モードは入射光蛍光、反射蛍光、または簡単な落射蛍光とも呼ばれる。典型的な現代反射光蛍光顕微鏡は、図1に示すように、各種コントラスト強化モードにおける透過光観察も備えている。顕微鏡は電荷結合素子（CCD）撮像システムに結合された三眼観察ヘッドを含み、光を透過するための2つの照明源と、観察観察（それぞれタングステン−ハロゲンと水銀アーク放電）のためのもう1つの照明源を有する。この設計された顕微鏡は、反射光蛍光と透過光位相コントラスト、微分干渉コントラスト（DIC）、偏光またはホフマン変調コントラスト観察を組み合わせて、または交互に行うことができる。

任意の蛍光顕微鏡の基本的な特徴は、選択的に濾過された照明を有する試料を励起するための機構を提供し、次いで、暗い背景上に大きな感度で画像を形成するために、第2のフィルタを用いてより弱い蛍光発光を分離することである。多くの実験では、生体試料中の局所プローブ濃度は非常に低く、励起光のほんの一部だけが蛍光物質に吸収された。また、一定量の照射を吸収できる蛍光団では、二次蛍光を発する割合はさらに低い。得られる蛍光発光輝度レベルは、照明の輝度レベルよりも3〜6桁低い。したがって、蛍光顕微鏡の基本的な問題は、より強い照射バンドから効果的に分離された弱い蛍光発光を捕捉しながら、試料の効率的な照明を生成することである。これらの条件は、2色ビームスプリッタの役割と特性に基づいて励起と発光の要件を調整するフィルタの組み合わせによって、現代蛍光装置において満たされている。

図2は、緑色領域（550 nm）で励起され、赤色（620〜660 nm）波長の蛍光を放出する蛍光団を含む仮想試料を含む反射光蛍光顕微鏡の青色ビームスプリッタ（ミラー）機能の背後にある原理を概説している。可視スペクトル高強度光源は、広い範囲の励起波長を高フラックス密度（通常、紫外線の大部分と可視スペクトル全体をカバーする）で出力し、これらの波長は照明器を通過し、最初に適切な励起帯域を選択するフィルタに遭遇する（EFと表記、図2（a）参照）。この場合、フィルタは510〜560ナノメートルの波長の光を効率よく通過するが、他の波長がより小さな程度で通過することも可能である。励起光は次に、2色鏡（図2のDM）に到達し、対物レンズの後孔に反射されて、試料を照射するテーパ照明を形成する。2色ミラーは光路中に位置し、45度の角度を呈し、490と565ナノメートルの間の波長（図3に示すように）を選択的に反射しながら、より短い波長とより長い波長を伝送するように設計されている。

図3に、図2の蛍光発光から励起光照射を分離するためのフィルタを組み合わせた透過曲線を示す。励起フィルタスペクトル（赤色曲線）は510〜560ナノメートルの間で高いレベルの透過率（約80%）を示した。中心波長（CWL）535 nm。二色鏡（黄色曲線）は、励起スペクトル領域内の波長を反射しながら、より高い波長とより低い波長を比較的高い効率で通過する。なお、2色ミラー曲線上の透過率のパーセントは100%反射に対応する。490〜570ナノメートルの間の透過分布における顕著な低下（反射率のピークを表す）は、励起フィルタから試料に90度の角度で入射する波長帯域を反射するために用いられる。光学系の次のコンポーネント、すなわち発光またはバリアフィルタ（白色曲線）は、黄色、オレンジ、赤色の可視光に対応する590ナノメートルを超える波長を透過する。様々な重畳スペクトルの透過と反射帯域間の境界は、反射と透過の波長がほぼ*分離されるようにできるだけ急峻に設計されている。2色鏡スペクトルに正弦波の上昇と下降スパイクが現れるパターンは、薄膜堆積過程の一般的な効果であり、鳴り止まないと呼ばれている。このフィルタ組み合わせの性能は非常に優れており、薄膜干渉フィルタ技術の急速な発展を明確に証明している。

狭帯域幅の光のみが2色鏡で反射されるため、上方の光をオフにして示すように、励起フィルタを通過する490ナノメートルより短く565ナノメートルより長い照射波長も2色鏡を通過するように工夫されている。図2（a）において。なお、励起光の反射は100%有効ではないので、少量の緑色光は2色鏡を通過して反射されない。また、すべての波長が565より大きいか490ナノメートル未満の光が鏡を透過するわけではありません。この光の一部は、対物レンズを介してミラーによってサンプルに反射される。

緑色光励起によって生成された試料の蛍光発光（主に赤色波長）は、対物レンズによって集光され、2色鏡及びバリアフィルタ（図2（c）において遮断された光線以上）を通過する。バリアフィルタ（BFと表記された図2では、波長590ナノメートルを超える光のみが顕微鏡接眼鏡および／または検出器に到達するように特別に設計されている。このタスクに使用する場合、バリアフィルタは、サンプルから反射された（そして2色ミラーを通過することに成功した）励起光の波長が検出器に到達するのを効果的に防止する。しかし、試料から戻った励起波長の大部分は、2色鏡（図2（c）中のカットオフ光以下の光）によって励起フィルタと発光器に反射される。図2および図3に示すフィルタ構成の正味効果は、強度が著しく高い励起光をより弱い蛍光発光から分離することである。すべての場合、図に示すように、蛍光顕微鏡に係るフィルターのカットオフレベルはそうではありませんが、波長範囲外のいくつかの光線を透過させることができます。図2（b）には、有効反射光蛍光顕微鏡に必要な光学経路及びポリシーフィルタの配置を示すイベントシーケンス全体が図形的に示されている。

すいちょくけいこうしょうめいき

現代の蛍光顕微鏡の核心は、観察観察管と対物レンズを携帯する汎用反射光垂直照明器である対物レンズ変換器間は、図1および図4に示すように。照明器具は、最初に顕微鏡対物レンズを通して試料の方向に光を向け、次に同じ対物レンズを用いて試料からの光を捕捉し、強度源を試料上に置くことによって、ハイライトから生じる光を導くように設計されている。このタイプの照明戦略にはいくつかの利点がある。顕微鏡対物レンズは、まず良好に補正された集光器として機能し、その後、接眼レンズまたはカメラ検出システムに伝送するために撮像蛍光発光を収集する。したがって、対物レンズは常に各機能に対して正確に位置合わせされます。さらに、試料によって散乱または反射された励起光の大部分は、透過蛍光照射の場合のようにガラスに直接投射するのではなく、（360度の角度で）対物レンズ前レンズ素子から離れている。この効果は正面照明と呼ばれ、特に厚い標本に適している。その後、照射された標本領域は観察された同じ領域に制限され、照明と光収集は対物レンズの全開口数を利用することができる。

垂直照明器の遠位端には、高強度アーク放電またはフィラメントベース白熱灯光源を含むランプボックス（図4参照）がある。人気の照明光源は高圧100ワット水銀アークランプ（HBO、一般にバーナーと呼ばれる）であるが、キセノンとメタルハライドランプ、レーザとハロゲン化タングステン白熱ランプもこの目的で使用できる。光源からの光は集光レンズ系によって集光され、デスクトップに平行で顕微鏡光軸に垂直な照明器の内部に沿って進行する。図4に示す発光器設計は、多アセンブリコレクタレンズシステムを含むが、近赤外及び紫外領域における色差補正を改善するために非球面レンズ素子も実施する。赤外波長を除去または抑制するために設計された熱フィルタは、ランプボックス自体の内部または垂直照明器の後部に隣接するランプボックス取付座に配置される。さらに、いくつかの顕微鏡は、照明器の他端に含まれる蛍光フィルタ群の性能を微調整するために、励起の不要な波長を選択的にフィルタリングするための二周波数または多周波励起イコライザランプボックス付近のシステム（図4および図8参照）を含む。

垂直照明器のランプボックスの近くにもあるのは、システムを通過する光の全強度を調整し、蛍光の退色や光漂白を減らすために使用できる中性密度フィルタのセットです。これらのフィルタは、通常、サンプルの蛍光を観察しながら光路に素早く挿入し、光路から除去できるようにスライダフレームに取り付けられている。Köhler照明を確立するために、垂直照明器は中央に位置可能な絞りと視野絞りの組み合わせを含み、両者とも可変の絞り開口を持ち、場の大きさと照明強度を決定した。開口およびフィールド絞りの対中および絞りサイズの調整は、垂直照明器ハウジングの各外側に配置された数組のつまみによって達成される。いくつかの設計では、照明器具を通過する光量を大きくするために、光路から絞りアセンブリ全体を除去するスライダつまみが提供されています。その他の顕微鏡は固定サイズのピンホールを含み、スライダに取り付けられ、光路を挿入でき、照明場を大幅に制限し、光漂白後の蛍光回復（FRAP）調査などの特別な応用に適している。

垂直照明器の光学系におけるフィールド絞りと絞りの後はフィールドレンズであり、光を拡散し、コラー照明を確立するために十分な照明場を生成するのに必要なフィールドレンズである。フィールドミラーの後、すべての近代的な垂直照明器は、蛍光を観察したり記録したりしていないときに、強い励起光がフィルタ群とサンプルに到達するのを阻止するためのシャッタ（手動スイッチ制御を有する）を含む。シャッタは蛍光顕微鏡の重要な特徴であり、試料の連続照射は光漂白による発光を著しく減少させることができ、高強度光は生細胞に対して不健康であるためである。また、シャッタはアーク放電灯を可動状態（予熱時間を軽減）に保ちながら、透過光で標本を瞬時に検査する。蛍光顕微鏡は通常、電子シャッターを備え、照明を迅速に遠隔制御することができる。紫外線防止カバー（図4に示された呼吸カバーは照明器ケーシングの前部に取り付けられ、オペレータがシャッターを開けたときに潜在的に危険な短波紫外線放射を予期せず漏らさないように保護する。観察時に検体を呼出ガスから保護することにより、カバーは二重作用を果たす。

いくつかの垂直照明器設計は、蛍光偏光研究に使用できる矩形偏光器フレームのための溝を提供する。ほとんどの場合、偏光子はフィールドミラーの後ろの照明光路に挿入されますが（共役平面から離れて）、シャッタの前にあります（図4参照）。偏光子は所定の透過方位で固定されていてもよく、あるいはギアセットに取り付けられていて、ホイールを用いて透過軸の方向を変えることができる。偏光子はスライドフレームに取り付けられているので、使用しないときに光路から容易に除去することができます。付属の分析計（蛍光異方性測定に必要な第2の偏光子）は、フィルタブロック回転塔の上の垂直照明器、または特別に設計された偏光顕微鏡中間管に設置することができる。補助管は通常、偏光子と顕微鏡光軸に対する分析器の透過方位の正確な位置を確保するために、ランプ状の回転偏光子ユニットを挿入することができる。

垂直照明器の後段には、蛍光フィルタの組み合わせを含む光学ブロックが取り付けられた回転テーブルまたはスライドブラケットが含まれている。特定の蛍光フィルタを用いて画像形成を組み合わせる必要がある場合、フィルタブロックは光学系に回転（またはスライド）する。単一ブロックには、試料照射を大幅に向上させ、特定の波長の蛍光発光を捕捉するために、整合した励起および発光フィルタのセットと、2色分光器のセットが含まれています。光学ブロックタレットとスライダホルダは、1つが光路内にあり、他のブロックが一時記憶域内で回転またはスライドする3〜6つの個別のブロックを積載することができる。2つ以上の蛍光プローブで標識されたサンプルを観察すると、これらのアクセサリは蛍光フィルタ群間で急速に変換することができる。蛍光照明器を備えた顕微鏡における透過照明の使用は、ターンテーブルまたはスライダホルダに取り付けられたスロット内の仮想光学ブロックによって促進される。仮想ブロックは、シャッターが開いているときに励起放出を阻止するが、フィルタを含まず、対物レンズから観察管を通過する光を妨げないようにする。

標準的なモジュラー型直立顕微鏡では、垂直照明器は顕微鏡フレームと観察管の間（図1参照）。多くのメーカーは、偏光器、DICプリズム、またはその他のアクセサリのために、照明器と接眼レンズユニットの間に挿入可能な中間管を提供している。現代の顕微鏡フレームワークは通常、顕著な制振と強化された人間工学的特徴をもたらすコンピュータ支援設計の努力の結果である。金属系セラミックスやアルミニウム複合材料などの合成材料は、フレームの静止性と熱剛性を大幅に向上させることができ、それにより機器は先進的な蛍光技術の厳しい要求に耐えることができ、これらの技術は長時間にわたって*振動を除去して弱い蛍光発光をイメージングする必要がある。

Kōhler蛍光顕微鏡照明

蛍光垂直照明器では、フィラメントまたはアーク放電プラズマ球が集光レンズの主焦点付近に位置するように光源が配置される。Köhler照明では、ランプ集光レンズは全体的な照明を強化するために、顕著に増大した補助光源として機能する。Köhler照明の主な要件の1つは、フィラメントまたはアークの画像が対物レンズのバックフォーカス平面に最終的に投影されなければならないことであり、反射光照射の励起中も（通常は高開口数）集光器の2倍である。理想的には、光源は対物レンズの開口全体を充填し、放射強度を大きくし、均一な照射の場を生成しなければならない。場合によってはホットスポット)。ただし、拡散フィルタは照度を下げることもあるので、できるだけ使用を避けるべきです。

反射光Köhler照明（図5に模式的に示す）において、光源の画像は、集光レンズによって垂直照明器内に位置する開口絞りフィルム上に集光される。この絞りは対物レンズの後孔とランプアークまたはフィラメントと共役平面を共有しているので、照射の場孔径寸法を決定する。光源、垂直照明器開口絞り、対物レンズ後焦点面（瞳）とともに共役平面の照明群を形成する。透過光顕微鏡の場合とは異なり、物理的に位置するのではなく、開口絞りと光源が対物レンズ（集光器として機能する）の後開口平面上に結像される。この構成の追加的な利点として、対物レンズが励起照射を提供したり、凝集した蛍光発光によって画像を形成したりする場合、すべての障害物（例えば虹彩絞り）が光路から除去される。開口絞りをオンまたはオフにすることで、迷光を制御し、照明場のサイズを変更せずに照明の強度（開口数）を調整することができます。画像では、開口絞りの調整が輝度とコントラストに影響を与えます。

反射光Köhler照明における共役平面の結像またはフィールド群は、フィールド絞り、サンプル表面、および中間画像平面からなる。したがって、その場で絞りがサンプル平面に焦点を合わせたとき、光源の画像は焦点から顕著に除去され、均一な照明場を提供する。視野絞りは、被観察領域の照明強度に影響を与えることなく、照射場の大きさを制御する。実際には、フィールド絞り開口寸法はできるだけ小さくして、画像コントラストを増加させ、直接観察されていない領域での光漂白度を減少させるべきである。アーク放電やフィラメント光源の多くは照明強度が均一ではないが、Kōhler照明はサンプル場に均一に照射することができる。顕微鏡を正しく配置すると、対物レンズのバックフォーカス平面*が明るくなり、エッジからエッジまで均一に明るい領域が提供されます。理想的には、Kowhler照明は集光器の開口部に結像された光源上の個別の点から形成された集光された波面のセットでサンプルを入浴する。正確に配置された蛍光顕微鏡では、結果として画像コントラストと分解能が得られる。理想的には、各波面は集光器の開口部に結像された光源上の異なる点によって生成される集光された波面のセットで試料を入浴する。正確に配置された蛍光顕微鏡では、結果として画像コントラストと分解能が得られる。理想的には、各波面はイメージングされた集光レンズ開口部の光源上の異なる点によって生成されます。正確に配置された蛍光顕微鏡では、結果として画像コントラストと分解能が得られる。

光源と灯台

蛍光顕微鏡における厳密な定量分析のためには、試料照射は視野全体にわたって時間的及び空間的に一定でなければならない。時間的な不安定性は、電源出力の変化によるランプ放射の変動を反映することが多い。逆に、アークランプによく見られる空間的摂動は、プラズマ球が電極上を往復移動するため、シンチレーションと呼ばれる現象に由来する。フリッカは通常、電源変動、電極抵抗の小さな変化、または機械的振動によって発生する。一般的なハロゲン化タングステンランプなどのフィラメントベースの光源は、定電圧電源を用いた定直流で動作する際に非常に安定している。一般に、光源はそのスペクトル含有量、対物レンズ後の開口領域と比較したフィラメントサイズ、空間的及び時間的安定性及びフィールド照明の均一性から選択されるべきである。励起フィルタが通過する狭帯域波長は全発光器出力の非常に小さい部分のみを含むため、光源の強度にも特に注意しなければならない。

蛍光顕微鏡用の光源を選択するための主な考慮事項は、研究されているけいこうせんりょうの量子収率と吸収に関する紫外線と可視光スペクトル分布を測定した。また、光源は、人間の目、従来のフィルム、光電子増倍管、拡張ビデオ管、デジタルカメラシステムのいずれかで、撮像画像に使用される検出器の感度と互換性がある必要があります。選択は照明モードにも依存します。アーク放電またはタングステン−ハロゲン源を用いて広視野蛍光顕微鏡の要件を満たし、共焦点および多光子顕微鏡は各種レーザシステムに適応する必要がある。タングステンとタングステン−ハロゲン白熱灯の使用は、発光の大部分がスペクトルの赤色と赤外領域で発生し、蛍光団の大部分が紫外、青色、緑色の波長で励起されるため、限られた成功を収めた。また、アーク放電ランプの光出力は、透過光照射に通常用いられる12ボルトの石英ハロゲンランプより10〜100倍明るい。広視野蛍光顕微鏡の人気の光源は水銀アークランプであり、通常は基本モデル顕微鏡構成に含まれる。場合によってはキセノンとメタルハライドランプが使用されるが、これらは通常、スペクトルと強度分布が特定の蛍光団要件と一致する特殊な場合に限られる。

水銀とキセノンランプは、電球の外殻の物理的なサイズとガスを除いて、設計が似ている。水銀ランプは、気化した元素水銀を含む高圧下で石英ガラスバルブに密封された2つの電極を含む。電源がオンになると、一連の高圧パルスが電極に送られ、水銀ガスの小部分がイオン化され、ランプが点火される。焼成後、電圧が低下し、電流を担持するためにイオン化ガスが使用され、2つの電極間に形成されたプラズマ球が生成される。ランプ動作中、水銀の蒸発はガラスバルブ内に大量の熱と圧力を発生させ、最終的に高強度の光を発生させる。水銀アークランプが発生する光は、紫外線と可視スペクトルの範囲内で連続していても、365400440546と580ナノメートルの離散波長に集中している。紫外線から赤外線まで、キセノンランプはスペクトル全体にわたってより均一な強度分布を持っている。蛍光染料の選択は、蛍光顕微鏡の適切な光源を決定するために重要である。いくつかの蛍光プローブは突出した水銀線と重なる励起バンドを有し、他の蛍光プローブはキセノンランプのより均一な分布の照射から恩恵を受ける。

蛍光顕微鏡におけるアークランプの正確なアライメントは、コーラー照明を実現し、蛍光画像における明暗領域を回避するために重要である。したがって、ランプボックスの品質は、通常、正確なランプアライメントの安定性とアライメントを維持するための調節つまみの効率によって判断することができる。ランプソケットには、円弧画像が対物レンズの後孔の中で中心になるようにランプ対の中ねじを配置し、ランプボックスには遠赤色と赤外線の長波長を遮蔽する赤外線フィルタを備え、大量の熱を発生させる必要があります。いくつかのランプボックスには、いくつかの用途で視野を介して見られる赤色の背景を除去するために、組み込まれた赤色抑制フィルタ（例えば、Schott BG 38）、またはそのようなフィルタのためのスロットが設計されている。さらに、ランプボックス自体が有害な紫外波長を漏洩してはならず、好ましくは、動作中に意図せずにハウジングを開く場合、ランプを自動的に閉じるためのスイッチを含むべきである。後、ランプボックスは、運転中に可能な燃焼器の爆発に耐えるために十分に堅固でなければならない。

蛍光顕微鏡の応用の広範な多様性は、通常、特定の蛍光団とイメージング条件の要件を満たすために一連の光源を必要とする。場合によっては、超感度カメラシステムとの組み合わせは非常に低い放射線を必要とする可能性があり、他の研究では、生細胞を殺すために強いレーザー励起を必要とするか、蛍光団を選択的に漂白する必要があるかもしれない。波長には、通常、スペクトルの可視領域全体、および紫外線と赤外線の部分を横断する必要があります。1つの光源ではこれらの多くの照明要件を満たすことができないため、メーカーが現在提供しているアダプタは、2つ以上のランプを1つの顕微鏡に同時に接続することができます。

蛍光フィルタの組み合わせ

前述したように、垂直照明器を通過するレンズと絞りの光は、照明器の光路と顕微鏡光学系との間の軸方向交差点に重なるように配置された光学ブロックに収容された励起フィルタに最終的に遭遇する。励起フィルタはランプによって生成された広いスペクトルから狭帯域波長を選択し、2色ミラーに渡し、2色ミラーは対物レンズを通して光を反射してサンプルに照射する。接眼絞りを固定して画像を形成する前に、対物レンズによって集められた蛍光発光は再び2色鏡と発光またはバリアフィルタを通過する。広帯域蛍光顕微鏡で帯域を分離するための一般的なフィルタには、ステンドグラスフィルタと干渉フィルムフィルタ（または両者の組み合わせ）が含まれる。蛍光顕微鏡照明およびイメージングスキームの各ステップに適切なフィルタを決定することは、フィルタ製造業者が多く、各フィルタ製造業者は蛍光文献に独自の英数字命名法を提供しているため、混同を引き起こす可能性がある。

図7に典型的な例を概略的に示す蛍光励起ブロックの解剖学的構造、及び二色鏡、励起及び障壁フィルタの相関スペクトルプロファイルを含む。フィルタブロックは通常、製造業者が提供するカスタムツールによって組み立てられるので、オペレータはフィルタと2色ミラーを交換することができる。励起およびバリアフィルタは、固定クリップ、光学ゴム、または円形ねじ取付座を介して所定の位置に固定される（図7参照）。一般に、これらのフィルタは、平坦な外側表面上の窪み穴の上にあるので、光学ブロックを開かずに除去することができます。2色ミラーの交換はさらに困難で、内部に入るにはブロックを取り外す必要があります。ブロック部分の多くは45度対角継手を用いて鋳造され、内部を保護し、適切な角度で2色鏡を支持することにより、2重の任務を実現することができる。ブロック部分を一緒に固定しているファスナー（ピンまたはビス）を取り外した後、固定クリップを緩めたり移動したりすることでミラーを取り外し、ブロックから慎重に取り出すことができます。干渉コーティングは一般的に保護されておらず、傷が付きやすいため、二色ミラーは慎重に処理する必要があります。顕微鏡会社を供給するいくつかのフィルターメーカーも、各種アフターフィルターと二色鏡を提供し、各種蛍光応用に適している。ブロック部分を一緒に固定しているファスナー（ピンまたはビス）を取り外した後、固定クリップを緩めたり移動したりすることでミラーを取り外し、ブロックから慎重に取り出すことができます。干渉コーティングは一般的に保護されておらず、傷が付きやすいため、二色ミラーは慎重に処理する必要があります。顕微鏡会社を供給するいくつかのフィルターメーカーも、各種アフターフィルターと二色鏡を提供し、各種蛍光応用に適している。ブロック部分を一緒に固定しているファスナー（ピンまたはビス）を取り外した後、固定クリップを緩めたり移動したりすることでミラーを取り外し、ブロックから慎重に取り出すことができます。干渉コーティングは一般的に保護されておらず、傷が付きやすいため、二色ミラーは慎重に処理する必要があります。顕微鏡会社を供給するいくつかのフィルターメーカーも、各種アフターフィルターと二色鏡を提供し、各種蛍光応用に適している。

蛍光フィルタ設計には、長パス、短パス（エッジフィルタ）、狭帯域、中帯域、広帯域フィルタシリーズが含まれる。図7に示すスペクトルは、いくつかの一般的なフィルタプロファイルの例を示している。図7の発光フィルタスペクトル（青色曲線）は、約575ナノメートルのカットオフ波長を有する長通干渉フィルタによって生成される。長い波長はフィルタを介して伝送され、短い波長はブロックされる。同じグループからの狭帯域通過励起フィルタ（赤色曲線、図7）は約20ナノメートルの帯域幅を有し、2色ミラー（緑色曲線）はほぼ中（455〜490ナノメートル）の透過領域と広帯域通過フィルタ（560〜775ナノメートル）を有する。2色ミラーは、緑色のロングパスフィルタ、可視スペクトルの黄色と赤色の領域（560〜700 nm）として効果的に使用されるため、フィルタ群で処理される。蛍光団吸収及び発光スペクトル分布を用いて適切な蛍光顕微鏡フィルタ群を選択する方法に関する作業知識は、この技術を成功裏に実施するために*である。

二色鏡（またはビームスプリッタ）は蛍光顕微鏡フィルタの組み合わせにおいて重要な部品であり、多層誘電体材料の公差を持つように製造された長通干渉型フィルタと類似している。二色鏡と標準干渉フィルタとの主な違いは、鏡が特定の境界波長で反射と透過を行うために設計され、顕微鏡と発光器の光軸に対して45度の角度で動作しなければならないことである。2色ミラーを、短い励起波長を光学系を介して90度の角度でサンプルに反射するために干渉コーティングを励起光源に向けるように配置した。同じミラーも、長波長蛍光発光を対物レンズから像面に伝達するための透過フィルタとして機能しなければならない。ほぼ全反射と大透過の間の波長遷移領域は通常20または30ナノメートルに限られるので、2色ミラーは励起と発光の波長を正確に区別することができる。

蛍光フィルタ群を設計することにより、特定の励起波長帯が二色鏡中の反射領域と正確に一致するようにした。その結果、励起光は顕微鏡によってサンプルに効果的に反射される。試料の蛍光発光は、これらの波長が検出器を通過できるように、2色鏡中の高透過領域と一致しなければならない。バリアフィルタはスキーム全体ではあまり重要ではありませんが、散乱と反射を除去する励起波長、ターゲット以外のプローブからの蛍光、自発蛍光による一般的な背景強度を確保する上で重要な役割を果たしています。フィルタグループを作成する重要な要素は、送信、反射、関連するフィルタの送信カーブが対応する領域の送信カーブに一致することを保証することです。そうしないと、励起波長は2色鏡を通過して画像をぼかすことができたり、蛍光発光は意図せず鏡で反射して画像の明るさを損なうことがあります。

完全に一致しているように見えるフィルタの組み合わせでも、各フィルタのスペクトル分布間のわずかなオーバーラップが発生し、パフォーマンスが低下する可能性があります。特に注目すべきは、いくつかの励起光がミラーを通過し、フィルタブロックの壁から反射できるようにする励起フィルタと2色ミラーとの間のクロストークである。上述したように、高傾斜角度で反射された光は、画像コントラストを低減するためにバリアフィルタを部分的に透過することができる。このフィルタを通過する漏れは、透過または交差と呼ばれ、実際にはすべてのフィルタの組み合わせが多かれ少なかれ発生する。フィルターメーカーと顕微鏡会社が注目している主な分野の1つは、交差レベルを下げるために蛍光フィルターの組み合わせの設計を改良することです。

蛍光フィルタ群のいくつかの構成を図8に示す。フィルターブロック回転塔（図8（a）））は、少なくともこの数の蛍光団を研究しながら、フィルターの組み合わせ間で迅速に変換できる5つのブロックを含む。タレット溝の1つには、通常、光を透過するために仮想光学ブロックが充填されているか、または空にしておくことができます。励起イコライザ（図8（b））を用いて励起スペクトルを微調整して、回転ジョイントに取り付けられた単一干渉フィルタを含む二重又は多重標識試料を撮像した。回転励起イコライザの調整レバーは、フィルタのバンドパス透過領域をより短い波長に移動させる。したがって、イコライザフィルタが0度入射角（垂直照明器軸に垂直）から大回転角度45度に回転すると、フィルタのバンドパス領域は25〜50ナノメートルの間の値を移動することができる。励起イコライザは、発光強度が等しくなるように観察下の蛍光染料の励起帯域幅を変化させるために、単独でまたは直列に使用することができる。この特徴により、いくつかのプローブを含むサンプル中の蛍光団強度を微調整することができ、例えば、1つのプローブからの蛍光発光を減少させ、同時に別のプローブの強度を増加させることができる。励起イコライザは、発光強度が等しくなるように観察下の蛍光染料の励起帯域幅を変化させるために、単独でまたは直列に使用することができる。この特徴により、いくつかのプローブを含むサンプル中の蛍光団強度を微調整することができ、例えば、1つのプローブからの蛍光発光を減少させ、同時に別のプローブの強度を増加させることができる。励起イコライザは、発光強度が等しくなるように観察下の蛍光染料の励起帯域幅を変化させるために、単独でまたは直列に使用することができる。この特徴により、いくつかのプローブを含むサンプル中の蛍光団強度を微調整することができ、例えば、1つのプローブからの蛍光発光を減少させ、同時に別のプローブの強度を増加させることができる。

薄膜コーティング技術の急速な発展は、単一干渉フィルタ内に複数の透過ピークを生成し、2色ミラー内に千鳥状の反射および透過バンドを製造する能力によって証明することができる。適切にマッチングすると、2つのマルチバンドフィルタと2色ミラーを組み合わせて、複数の蛍光団の発光を同時に励起し観察できる複数の蛍光フィルタ群を生成することができる。フィルタセットは、同じサンプル中の2つ、3つ、または4つの蛍光団に適した製造業者から得ることができる。複数のフィルタ群の主な問題は、それらの費用と、1つの蛍光プローブからの発光が別のバンドパス領域を通過する際に発生する過剰な交差または透過である。いくつかのサンプル（およびフィルタセット）では、透過は背景強度と画像コントラストに顕著な影響を与える。多くの研究者は、最適化されたフィルターセットを用いてそれぞれの蛍光団をイメージングし、その後画像を複合体に組み合わせる傾向がある。

先進的な蛍光技術では、通常、単一の2色鏡を有する複数の励起及び発光フィルタを使用する必要がある。これらの研究を容易にするために、多くの蛍光顕微鏡は6つの個別のフィルターを含む電動フィルターホイールまたはスライダを備えている（図8（c）参照）。スライダ用に設計された顕微鏡または垂直照明器にスライダを挿入するための特別な溝を含めるか、あるいはフィルタスライダは通常中性密度フィルタを含むスライダの代わりにすることができる。いくつかの顕微鏡設計では、垂直発光器はまた、発光スライダを収容することができ、または発光器と観察管との間に取り付けられた補助中間管は、スライダを収容することができる。直立および逆さま顕微鏡において、励起フィルタを含む電気フィルタユニットは、通常、中性密度フィルタとランプボックスとの間の垂直照明器光学通路に挟まれている。同様に、電動放射フィルタユニットは垂直顕微鏡設計では垂直照明器と接眼観察管の間に配置されているが、通常は倒置機器用の検出器と同じ外部ポートを介して接続されている。励起及び発光スライダ及び電気フィルタホイールは、単一の2色ミラーを用いた2重及び3重励起用途に非常に有用である。単一サンプルを観察する際にフィルタブロックを再配置する必要性を排除することにより、これらの添付ファイルは、研究者が画像間の正確な位置合わせを得ることができるようにする。

蛍光顕微鏡の対物レンズ

すべての形態の反射光顕微鏡（蛍光を含む）において、画像強度は対物レンズの開口数と増幅率の関数である。実際には、強度または輝度（単位面積と時間当たりの光子束として定義）は開口数の4乗を増加させますが、拡大率の2乗にのみ反比例します。

強度α（NA obj）4/M 2

ここで、NAは対物レンズの開口数であり、Mは倍率である。この関係から明らかなように、明るい蛍光画像は高い開口数および0.75/20 xなどの低増幅率の対物レンズ凝集。例えば、開口数1.4の60 x計画複素色収差油浸漬対物レンズは、理論的には同じ開口数の100倍対物レンズよりも明るい画像を生成するが、トレードオフを考慮する必要がある。内部レンズ素子の数を増やすと（高開口数対物レンズと同様に）自発蛍光と内部レンズ表面からの強度減少反射の対応する増加が生じる。一般的に、製造業者は、その推奨蛍光顕微鏡対物レンズにおいて、大学正因子と増加した光透過との間のトレードオフを行う。

一般に、高開口数油（1.3〜1.4）及び水（1.2）は、その巨大な集光能力により、計画蛍石及び平面複素色収差対物レンズに浸漬して明るい蛍光画像を生成する。これらの対物レンズは優れた色補正を示すので、複数の蛍光発光波長を同一平面内に集束することができる。複素消色差及び蛍石対物レンズの光透過特性は、紫外領域で励起される蛍光染料（例えばDAPI、Hoechst、Alexa Fluor−350及びAMC）を検査するための要件である約350ナノメートルと低いときに*である。内部レンズは多数あるが、これらの対物レンズは、バックグラウンド蛍光を大幅に低減し、非常にコントラストの高い画像を生成するために、反射防止コーティングを有する低蛍光ガラスで作られている。

特殊な用途に特化して設計された対物レンズは蛍光顕微鏡に広く用いられている。このクラスには、高開口数水浸し、複数回浸漬（油、水、グリセリン）、石英レンズ素子を有する紫外線対物レンズが含まれる。生細胞イメージング用途には、ボトル壁を厚く（0.5〜2 mm）培養することによりサンプルを観察するために、補正リングを有する長作動距離対物レンズが必要である。非常に長い焦点距離（作動距離）を有する対物レンズによって、厚い試料の奥深くの検査を促進することができ、これらの対物レンズは、空気または水によって眼鏡を覆って画像化するためにいくつかのメーカーから入手することができる。カバーガラスを持たないように設計された長作動距離水浸対物レンズにもTeflonフロントコーンがあるため、対物レンズを水溶液に浸漬することができる。20〜30 mm（約5 mmの水を含む）の動作距離で水中の紫外励起（340 nm）に対して同様の対物レンズを生成した。比較的低い倍率の研究には、*開口数（0.75〜0.95）を有する20倍水浸対物レンズを使用することが推奨されている。非常に高価であるが、これらの対物レンズは、蛍光団濃度および／または量子収率が微々たる場合に極めて明るい画像を生成する。

蛍光顕微鏡部品

製造業者は、蛍光顕微鏡において成長するイメージング用途の利用可能な選択肢を増やすために、その機器のために有用な追加部品ユニットを製造し続けている。例えば、いくつかの顕微鏡上で矩形電界絞り（図9参照）を選択することができ、これは、コントラストを高め、光漂白を低減するために照射されるサンプル領域を制限することができる。垂直照明器における従来の絞り絞り（取り外し可能なモジュールでもある）の代わりに、モジュール化されたフィールド絞りを用いて、デジタル撮像センサのアスペクト比に合うように設計した。矩形場停止はコラー照明の効率を高め、電子センサの信号対雑音比を低下させる。追加の利点として、逆畳み込み研究でプログラマブルスキャンフェーズを使用する場合、イメージの矩形サイズをフェーズステップサイズと一致させることができます。ピンホールは矩形フィールド絞りに似ており、高度に制限された照明場を必要とする用途に使用することができる。

他のアクセサリには、水銀やキセノンアーク放電ランプなどの2つの光源を垂直照明器に同時に接続するための2つのランプハウジングアダプタが含まれています。レーザーを励起するのに適した照明器は、全反射蛍光（TIRF）、蛍光寿命イメージング顕微鏡（FLIM）などの用途にも使用でき、比率イメージングと光漂白回復実験にも使用できる。さらに、主要メーカーが提供するほとんどの研究グレード蛍光顕微鏡は、それぞれのレーザー走査共焦点アセンブリに容易に適応することができる。直立型顕微鏡は三眼観察管を介して共焦点走査ユニットを受容し、反転装置はビームスキャナを顕微鏡フレームの側面または後ポートに接続することができる。垂直照明器と観察管との間に挿入された2つのポートは、追加の光源を導入するために、または1つより多い検出器に蛍光を導くために使用することができる。これらのほとんどのデバイスには、オプションのCマウントアダプタまたは標準顕微鏡ポートアセンブリが搭載されています。

電気生理学的研究のために設計された蛍光顕微鏡は非常に複雑になっている。多くの場合、蛍光、赤外差分干渉コントラスト（IR−DIC）を用いた実験用の各種マイクロマニピュレータアセンブリ、および従来の明視野コントラスト強化イメージング技術を使用するための専用のダンパー段を備えている。動物鏡の回転盤を振ることで、生きた細胞や組織をイメージングする際に標本や気泡の侵入を妨げることを防ぐために、対物レンズの迅速な無振動交換を実現することができる。新しい高開口数長作動距離2 xと4 xマクロレンズ（対物レンズ）を用いて生体中で蛍光巨視的観察を行うことができ、これらのレンズには専用のフィルタ結合ブロックが装備されている。さらに、一部の製造業者は、その立体顕微鏡の付属品として蛍光垂直照明器とフィルター群を提供している。

垂直照明器はオプションとして1.25倍から1.5倍の増幅係数を選択することができますが、空増幅の固有の問題を導入するため、補助レンズを使用して蛍光画像に入ることはできるだけ避けなければなりません。いくつかのモジュラー型垂直照明装置設計は、照明装置の上に含まれる複数のカメラポートを接続するためのビームスプリッタモジュールを備え、撮像能力を高める装置を含む。現在蛍光顕微鏡に使用できる様々な電動アクセサリ、対物レンズターンテーブル、集光レンズ、フィルターホイール、プラットフォームを考慮すると、研究者はこれまで以上に複雑なイメージング技術を得ることができる。メーカーは多くの複雑な蛍光用途の部品設計に多大な労力を投じており、これらの用途はかつて様々なソースからの*部品で構築された顕微鏡しか使用できなかった。蛍光顕微鏡が細胞生物学になるにつれて、神経生理学と臨床分野でますます重要なツールになってきた

リバース蛍光顕微鏡設計

同様のバージョンの垂直蛍光照明器は、倒置（組織培養）顕微鏡ホルダに使用することができる。また、フリップスタンドは、反射光蛍光と透過光顕微鏡の様々なコントラスト強化技術との組み合わせまたは交互化を可能にする。研究レベルの倒置顕微鏡は、複数（6個以上）の入出力ポートを有し、通常はフレームの片側に1つのポートがあり、後部の1つまたは2つのポート（上部と下部）と下部の下部ポート顕微鏡は、いくつかのモデルでは、中継レンズを使用する必要なく、3つ以上のポートから同時に主画像を得ることができる。この接続レベルにより、複数の光源、フィルターホイール、カメラシステムを用いて複雑な蛍光解析を行うことができる。倒置顕微鏡用の水銀及びキセノンランプシェードは、性能を向上させ、紫外及び赤外スペクトル領域の収差を低減するために、標準的な多素子又は非球面集光レンズとともに使用することができる。さらに、直立顕微鏡に使用できる付属品と同様に、さまざまなランプボックスアダプタを使用して複数の照明源を接続することができます。

図10には、Peltier冷却CCDイメージセンサと従来の35 mmフィルムカメラシステムを備えた現代の倒置（組織培養）蛍光顕微鏡の断面概略図を示す。フィルムはカメラの用途は限られていますが、ほとんどの倒置顕微鏡はフロントシャーシの下部にこれらのアクセサリ用のポートを含んでいます。図10に示す顕微鏡は、支柱に取り付けられたタングステン−ハロゲンランプボックスを用いて、従来の明視野透過照明（コントラスト増強を有するか、有さないか）を実行することができる。水銀またはキセノンアーク放電ランプは蛍光顕微鏡用であり、特殊な配置のリアポートに接続された反射光照明器を使用する。開口及びフィールド絞り、並びに中性密度フィルタは、顕微鏡後部のポート付近に進入する。いくつかの反転顕微鏡モデル（図示せず）において、アタッチメントを追加するために後方補助ポートへのアクセスを改善するために、ミッドダイヤフラムを含むL字型反射光照明器を使用することができる。図10において顕微鏡による光路は透過光を黄色、紫色は無濾過アークランプ照明、緑色は濾過蛍光励起、赤色光は蛍光発光を示している。

現代の倒置顕微鏡フレームは、それらの直立対応物のように、構造と熱安定性のためにコンピュータによって設計され製造された複合材料である。さらに、機械プラットフォーム部品および回路構造設計は、例えばDICプリズム挿入や対物レンズ補正リングの調整などの従来の動作で対物レンズステアリングを操作する際のピッチおよびヨーを回避するために、短ストローク距離と高剛性を有する。先進的な対物レンズターンテーブルステージは、遅延時間と長時間の蛍光観察において実際に焦点ドリフトを除去することができる。標準的な縦型顕微鏡では使用できない他のステージオプションには、スライドおよび360度回転ステージ、ガラスステージボード、ホットプレート、シャーレ、プレートホルダー、二酸化炭素培養箱があります。

モジュール化された設計を持つ倒置顕微鏡は、電気生理学、体外受精、顕微鏡操作、高分解能DIC、ビデオ増強観察、および様々な先進的な蛍光技術の研究のために容易に配置することができる。これらの機器は共焦点及び多光子顕微鏡にも容易に適用できる。電動部品には、ブラインド、フィルターホイール、回転対物レンズターンテーブル、蛍光ブロックターンテーブル、フォーカスドライバ、集光レンズが含まれています。高作動距離、水浸し、紫外励起と位相コントラストの高級対物レンズと結合すると、すべて高度な光学補正を持ち、逆さま顕微鏡は生細胞と組織蛍光研究を行う理想的な機器である。

結論

蛍光顕微鏡では、試料内の局所蛍光団濃度の間の広範な変化に加え、ある蛍光染料から別の蛍光染料までの消光係数と量子収率の違いが、定量的な励起強度に与える発光信号に顕著に影響する。多くのサンプルが任意の特定の視野に微量の蛍光材料のみを含むことを考慮すると、これらの結合因子によって生成される平均蛍光発光レベルは励起強度より4〜6桁小さい。さらに、インサイチュハイブリダイゼーションや共鳴エネルギー移動（FRET）など、より複雑な蛍光技術もあり、励起された発光信号強度よりも9〜10桁小さくてもよい。励起強度と発光強度の間のこれらの大きな違いを補償するために、現代蛍光顕微鏡は蛍光信号を妨害することなく励起照射を10億回以上減衰させることができる必要がある。

蛍光顕微鏡の主な特徴の1つは、特徴的な波長吸収と発光の蛍光プローブの高い特異性であり、その結果、この技術は複雑な混合物中で非常に低い濃度で対物レンズ種を選択的に検出することができる。さらに、蛍光の高感度と空間分解能により、顕微鏡の光学分解能以下の長さスケールで単一分子を正確に位置決めし、研究することができる。局所環境因子も蛍光発光に深刻な影響を与えるので、この方法はpH、粘度、イオン濃度、分子距離と配向、膜電位、疎水性、電荷分布と拡散係数の変動の理想的なプローブである。蛍光の時間分解能は、励起蛍光プローブの寿命に限定され、ナノ秒レベルであってもよい。多くの生物過程がこの時間帯に発生するため、崩壊動力学は細胞過程に関する動的情報を明らかにすることができる。総じて、これらの因子は蛍光顕微鏡の細胞生物学への応用において極めて重要である。

過去10年間、蛍光顕微鏡は驚くべき速度で発展し、同時にレーザー技術、固体検出器、干渉膜製造とコンピュータによる画像分析の面で同様に急速に発展した。高開口数水浸対物レンズの発展はさらに生物現象の研究に役立ち、研究者はその自然環境の中で生細胞を深く探査することができるようになった。顕微鏡メーカーが研究界の変化する需要に対応するにつれて、先進的な蛍光機器と部品の開発は間違いなく発展し続け、それらは自然の神秘を探索する最終的な貢献に深い意義を持つ可能性がある。