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外分泌体研究カードの殻？Simple Westernにより検出効率が2倍に
日付：2025-10-21読み：0
外分泌体（Exosomes）内体由来の小型脂質ナノ粒子で、直径は約30-200ナノメートルで、ほとんどの生細胞は細胞吐出作用を通じて積極的に外分泌体を分泌する[1]病理的にも生理的にも、外分泌体の放出は持続的であっても誘導的であってもよく、放出過程は動態性、制御性、機能相関性を有する。外分泌体の分子組成と放出量は、その由来細胞の状態に依存する。外分泌体は多種の細胞系、初代培養物から分離して得ることができ、血清、血漿、唾液などの生体液から抽出することもできる。源の多様性を考慮して、外分泌体は多効果の生理機能を持ち、さらに多くの研究により、癌、感染性疾病、神経退行性疾病などの多種の病理状態の中で重要な役割を果たしていることが明らかになった。そのため、外分泌体は液体生検方法における重要な研究対象となっている[2]また、外分泌体は工事によって改造することができ、有潜在的な薬物送達ベクター[3]。
外分泌体の体積が小さいため、複雑な生物基質から外分泌体を分離することは非常に挑戦的であり、分離収量は通常低い。この背景には、Simple Western™外分泌体を研究する理想的な技術となっている：この方法はわずか3マイクロリットルの試料を必要とし、しかも皮克級感度を備え、伝統的なWestern blotの必要な外分泌体量に対する要求を大幅に減少させた。その後、外分泌体関連抗原の特異的検出抗体を用いて特徴分析を行うことができ、これらの標的抗原は外分泌体の汎用マーカーであってもよく、その由来細胞または体液のすべてのマーカーであってもよい。本実験案では、市販の外分泌体標準品と抗体を用いてSimple Western™外分泌体の汎用標識物と源特異性標識物を検出した。
本記事では、「ヒト血漿、ヒト血清、ヒトA 549細胞（肺胞基底上皮腺癌細胞）」の3種類の外分泌体標準品を対象に、下表中の抗体の有効性を検証した結果を紹介する：
01.汎用外分泌体マーカーの発現
•Flotillin-1：クラシック汎用マーカーとして、3種類の標準品の中で検出された（図1 A）。
•Alix：3つの標準品で発現しているが、A 549細胞由来外分泌体ではより発現量が高かった（図1 D）。
02.ソース特異性マーカーの発現
•Annexin V：アポトーシスマーカーと血液抗凝固蛋白質として、A 549細胞、血漿由来外分泌体中に検出され、血清由来外分泌体中に検出されなかった（図1 B）。
•EGFR（HER 1）：A 549細胞由来外分泌体のみで検出され、血清、血漿由来外分泌体には信号がなかった（図1 C）。
図1 Simple Westernを利用する™外分泌体標的抗原を測定する。A：flotillin-1；B：Annexin V；C：EGFR；D：Alix。
03.特殊処理ニーズのマーカー
•CD 63：PNGase F（脱グリコシル化酵素）で外分泌体標準品を処理した後にのみ信号を検出でき、グリコシル化修飾がこの標識物の検出に与える影響を示唆する（図2）。
04.その他のマーカーの検証
表2中の残りの抗体（例えばAnnexin A 2、HSPA 8/HSC 70、TSG 101など）はすべてSimple Westernによって検証され、対応する外分泌体標準品中に目標信号を検出することができる（図2）。
図2.血漿及びA 549細胞由来の外分泌体標準品における各標的抗原の検出レーン図。
——Simple Western技術の核心価値——
（1）微量効率：3-5μL外分泌体分解液（従来のWBは50μL+）だけで、貴重なサンプルに適している、毛細管の全プロセスはサンプル損失を減少させ、低豊度膜蛋白質に適している。
（2）高感度：ピケ級検出下限、CD 63/Alixなどを測定でき、PNGase F処理を経てグリコシル化干渉を解読し、EGFRなどの特異性検出を実現する。
（3）耐マトリックス干渉：12-230 kDa毛細管電気泳動は煩雑さを取り除き、外分泌体が分解した後、直接機械に乗ることができ、煩雑な精製を必要としない。
（4）多重定量：単一サンプルの同期測定8個の標的、MISEV標準に符合し、動的範囲は6個の数量級をカバーする。
（5）自動化プロセス：3時間全自動化で結果を出し、蛋白分解を減少する、穴ごとに独立した品質管理を行い、外分泌体制を満たしてQCを準備する。
（6）正確な定量：絶対/相対定量を支持し、低サンプル量+高繰り返し性、液体生検マーカーの開発に適し、科学研究から臨床転化を加速する。
*本文は「ProteinSimple」ウィーチャット公式アカウントから転載
*参考文献：
1. エクソソーム、D M PegtelとS J Gould、生物化学の年次レビュー、2019、88:487-514。
2. 細胞外細細胞2. 細胞外2 2. 細胞外2 2 細胞外2 2 2 2. 細胞外2 2 2 2. 細胞外2 2 2 2. 細胞外2 2 2 2. 細胞外2. 細細胞外2.
3. 再構成可能な治療システムとしてのエクソソソーム, R Conlan, S Pisano, M Oliveira, M Ferrari and I Mendes Pinto, 分子医学の傾向, 2017, 23(7):636-650.
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