一、畢赤酵母発現システムの概要

ピキア酵母（Pichia pastoris）発現システムは高効率の真核発現システムとして、ピキア酵母発現システムは広範な応用分野と顕著な優位性を持っている。他の発現系と比較して、ビフィズス酵母発現系の優位性は明らかである。それは現在強く、制御機構が厳格なプロモーターの1つであるアルコキシラーゼ遺伝子AOX 1プロモーターを持ち、これにより外来遺伝子の発現制御がより正確で効率的になる。その発現レベルは高く、細胞内発現を実現することができ、また分泌型発現を行うことができ、異なる研究と生産の需要を大いに満たした。発酵プロセスは成熟して増幅しやすく、すでに大規模な工業化高密度生産の能力を備えており、産業化の発展に便利な条件を提供している。培養コストが低く、生成物が分離しやすく、使用する発酵培地は安価で、しかも蛋白を含まず、下流製品の分離精製に有利で、生産コストを下げた。外因性蛋白遺伝子は遺伝的に安定しており、ビフ酵母染色体に統合された後、染色体の複製に伴って安定して存在することができ、失われにくい。また、真核発現システムとして、ピキア酵母は真核生物のサブ細胞構造を有しており、発現されたタンパク質に対してグリコシル化、脂肪アシル化、蛋白リン酸化などの翻訳後修飾加工を行うことができ、発現されたタンパク質は構造と機能的に天然タンパク質に近く、より高い生物活性を有する。

二、畢赤酵母発現システム構成

1、宿主菌

現在、外因性蛋白質の発現に用いられているビフィズス菌は、Mut+メタノール利用型GS 115、X-33、SMD 1165、SMD 1163及びSMD 1168などの多くの宿主菌、MutSメタノールは緩慢型KM 71を利用し、Mut−メタノール不利用型MC 100−3。詳細は下表を参照して、詳細にはビフィズス菌の異なる発現宿主菌及び発現特徴を列挙した

表1よく見られるビフィズス菌発現宿主菌及び特徴

菌株	特徴
GS115	高発現レベル、高細胞密度、高可溶性蛋白産量を有し、現在広範な宿主菌を応用している
KM71	メタノールは緩慢型を利用し、溶けにくいタンパク質の発現に適している
X33	発現量と活性を向上させることができ、組換えタンパク質の発現に適している
SMD1168H	より良い発現効率とより高い細胞密度は、高分子タンパク質の発現に適している
SMD116（his4 pep4）	プロテアーゼ欠損型菌株に属し、蛋白分解を減少させ、蛋白分解による発現産物の分布ムラの問題を解決することができるが、この菌株の成長は相対的に遅く、発現の外因蛋白質の収量が低い可能性がある。
Y-11430型	効率的な表現能力と制御可能な表現

2、担体

畢赤酵母発現ベクターは統合型ベクターを主とし、一般的なベクターは細胞内発現ベクターと分泌発現ベクターに分けることができる。

表2一般的なビヒクル酵母発現宿用担体及び特徴

三、畢赤酵母発酵技術

1、畢赤酵母発酵段階

ピキア酵母の発酵は一般的に2つの段階に分けられる：1、細胞成長段階：まず炭素源がグリセリンまたはグルコースである培地中で行われる成長段階で、十分な細胞密度と生物量を蓄積し、菌体濃度が一定の段階に達した時、グリセリンまたはグルコースが枯渇すると、溶存酸素値が突然100%前後に上昇し、その後グリセリンまたはグルコース溶液を流し始め、通気量と攪拌速度を維持して、溶存酸素レベルが30%前後を維持し、さらに生物量（菌濃）を増加させる。2、誘導段階：バイオマスが要求に達した後、炭素源の補充を停止し、炭素源が枯渇し、過渡期が終わった後、炭素源をメタノールに切り替えて目標蛋白質の誘導発現を行う発酵段階。一般的には、0.3%メタノールを間欠的に2回添加して誘導し、次いでメタノールを流して発現蛋白質を誘導し始め、この方法は外因性蛋白質の発現レベルを高めることができ、そして比較的短時間でビヒクル酵母に高濃度の標的蛋白質を蓄積させることができる。

誘導発現段階はビフィズス酵母の発酵生産過程における重要な一環であり、この段階ではメタノールは特異的な誘導剤として使用され、以前の炭素源に取って代わる。ピカ酵母中のアルコキシラーゼ遺伝子（例えばAOX 1）はメタノールの存在下で活性化され、それによって外来遺伝子の効率的な発現を駆動する。この段階の条件制御は外因性蛋白の生産量と品質に重要な影響を与え、メタノールの添加量、添加速度及び発酵環境の温度、pH値と溶存酸素量などのパラメータを厳格に制御し、外因性遺伝子が持続的、効率的に発現できることを確保すると同時に、メタノールが細胞に毒性及びその他の不利な影響を与えることを回避する必要がある。

2、発酵培地の種類と配合

ピキア酵母発酵培地の種類は多様であり、異なる培地処方は異なる発酵段階と目的に適している。

BSM（基底塩）培地は、ピキア酵母発酵によく用いられる基底培地の1つであり、その典型的な処方は：85%リン酸26.7 ml/l、二水硫酸カルシウム0.93 g/l、硫酸カリウム18.2 g/l、七水硫酸マグネシウム14.9 g/l、水酸化カリウム4.13 g/l、グリセリン40.0 g/l、PTM 1 4.35 ml/lである。この培地は、窒素源、リン源、カリウム源、マグネシウム源などの無機塩およびグリセリンを炭素源として含む、ビヒクル酵母の成長に基本的な栄養成分を提供することができ、PTM 1は酵母の成長に必要な微量元素やビタミンなどの栄養物質を補充し、酵母細胞の正常な成長と代謝の維持に役立つ。

F 22培地は、異なる研究および製造用途において調整される可能性があるが、一般的には適量の炭素源（グルコースまたはグリセリンなど）、窒素源（酵母抽出物、ペプトンなど）、無機塩（硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、リン酸二水素カリウムなど）、およびその他の添加剤（ビオチン、微量元素溶液など）を含む一般的なビヒ酵母発酵培地でもある。BSM培地と比較して、F 22培地は、特定の発酵ニーズを満たすために栄養成分の組成および比率を最適化することができ、例えば、場合によっては外因性タンパク質の発現量を高めたり、タンパク質の品質を改善したりするのに有利である可能性がある。

上述の2つの一般的な培地のほかにも、具体的な実験目的、菌株特性、発酵プロセスの要求に応じて最適化され、調整されることが多い他のビヒ酵母発酵培地がある。例えば、いくつかの研究では、特定の基質に対するビフィズス酵母の利用効率を高めたり、環境圧力に対する耐性を高めたりするために、アミノ酸、有機酸、多糖などの特殊な成分を培地に添加したり、あるいは培地中の炭素源、窒素源、無機塩の割合を調整することにより、酵母細胞の成長と代謝経路を最適化し、より高い発酵効率と生成物収量を実現する。

3、発酵プロセスパラメータ

ピカピカ酵母の発酵過程において、プロセスパラメータの正確な制御は発酵の成否にとって極めて重要な役割を果たし、これらのパラメータはpH、温度、溶存酸素などを含み、それらは相互に関連し、相互に影響し、共にピカピカ酵母の成長状況、代謝活性及び外因性タンパク質の発現レベルを決定した。

pH値：ビフィズス酵母の発酵に影響する重要な要素の一つである。ビフィズス酵母は異なる成長段階と代謝過程において、pH値に対する要求が異なる。細胞成長段階では、一般的に適切なpH範囲は5.0-6.0であり、このpH条件下で、酵母細胞は良好な成長状態を維持することができ、酵素の活性も比較的によく発揮され、細胞の増殖と代謝産物の蓄積に有利である。pH値はビフィズス酵母の発酵過程において、菌体の成長状態に影響するだけでなく、外因性タンパク質の発現にも重要な影響を与える。pH値がビchi酵母に与える影響は主に以下の方面を含む：（1）細胞内酵素の活性に影響し、さらに細胞の新陳代謝に影響し、それによって外因性蛋白質の発現にも影響を与える、（2）細胞膜の透過性に影響し、細胞が栄養物質を吸収し、代謝産物を排出する際に一定の影響を与える、（3）pH値は培地中の成分と細胞の代謝産物の解離に影響を与え、それによって細胞が栄養物質を吸収することに影響を与える、（4）pH値も細胞の代謝過程に影響を与え、細胞代謝産物の含有量を変化させる可能性がある。また、高密度発酵過程において、外因性蛋白質がプロテアーゼによって分解されるのを減らすために、プロテアーゼ作用の最適なpH値を避け、pH値を外因性蛋白質などの電気点から逸脱するように設定することも、外因性蛋白質の収穫率を高めることができる。

温度：ビフィズス酵母の成長と代謝にも顕著な影響を与える。ピキア酵母の成長温度は一般的に28〜30℃が適当である。この温度範囲では、酵母細胞の成長速度が速く、代謝活動が旺盛で、培地中の栄養物質を効率よく利用して成長と繁殖することができる。しかし、温度が高すぎて32℃を超えると、細胞の膜構造、タンパク質、核酸などの生体高分子の安定性を破壊し、細胞の正常な生理機能に影響を与えるため、細胞が死亡する可能性がある。逆に、低い温度では、細胞の成長速度は遅くなるが、培養温度を適切に下げることで標的タンパク質の収量と品質が改善されることがいくつかの研究で明らかになった。これは低温は細胞内の蛋白質の折り畳み応力を下げ、誤った折り畳みの発生を減らすことができ、同時にプロテアーゼの活性を減らし、外因性蛋白質の加水分解の程度を下げ、それによって外因性蛋白質の正確な折り畳みと蓄積に有利であるためである。

溶存酸素（DO）：ビフィズス酵母の発酵過程におけるもう一つの重要なプロセスパラメータである。グリセリンとメタノールを用いた増殖と代謝には酸素の関与が必要であるため、適切な溶存酸素レベルを維持することは発酵の円滑な進行を確保する上で重要である。発酵プロセス全体にわたって、通常、溶存酸素濃度を＞20%のレベルに維持する必要がある。細胞成長初期には、菌体の数が少ないため、酸素に対する需要は相対的に低く、その際に適切な通気と攪拌によって細胞の溶存酸素需要を満たすことができる。細胞の成長と代謝活動の増強に伴い、酸素消費が徐々に増加している。この場合、細胞が十分な酸素を得て代謝できるようにするためには、通気量、攪拌速度をさらに調整するか、純酸素補充などの方法で溶存酸素レベルを高める必要がある。溶存酸素が不足すると、細胞の成長が遅くなり、代謝産物の蓄積が減少し、細胞死を引き起こす可能性があり、発酵の効率と産物の生産量に深刻な影響を与える可能性があります。

培養時間：ビスタ酵母発現システムにおいて最高の蛋白発現レベルを獲得する最も重要な要素の1つであり、ビスタ酵母発現システムにおいて、生産時間は比較的に長い（約100 h）。培養時間は酵母細胞の数と標的蛋白質の分解程度と関係があり、ある研究によると、パステピ赤酵母細胞の最高成長密度は培養96 hであり、最高蛋白質発現は48 h［11］で発生し、これは長い培養時間が発現蛋白質を加水分解消化する可能性が高いことを示し、他の研究によると、最適蛋白質発現時間は培養72 ~ 96 hで発生することも明らかになった［2］

畢赤酵母発酵プロセスは複雑で精細なプロセスであり、発酵段階、培地の配合とプロセスパラメータに対して精確な制御と最適化を行う必要があり、実験設計（DOE）方法を通じて、系統的に発酵条件、例えばpH、温度、溶存酸素と培地の組成を最適化して、十分に畢赤酵母の優位性を発揮させ、外因性蛋白の効率的な発現と生産を実現することができる。ピカピカ酵母の発酵特性と需要を深く理解し、先進的な発酵技術と設備を結合し、発酵技術を絶えず最適化することにより、ピカピカ酵母発酵の効率と製品品質をさらに高めることが期待されている。

四、畢赤酵母と発酵タンクの「暗黙の配合」

畢赤酵母の発酵過程において、発酵タンクは核心設備として、畢赤酵母の成長と代謝に重要な環境条件を提供し、それが外因性蛋白質を効率的に発現できることを確保した。

発酵タンクは正確な温度制御システムを通じて、ピキア酵母に適切な成長温度を提供する。前述したように、発酵槽の温度制御システムは、28〜30℃の増殖段階および誘導発現段階における温度の特定の要件を正確に維持し、酵母細胞の増殖およびタンパク質発現に悪影響を与えることを回避することができる。大規模発酵生産において、この正確な温度制御は特に重要であり、それは各ロットのピカピカ酵母が安定かつ適切な温度環境で成長できることを保証し、それによって生産の安定性と繰り返し性を高めた。

pH値の調整には、発酵タンクに先進的なpH検出と調整装置が装備されている。ピキア酵母発酵の異なる段階では、pH値に対する需要の変化に応じて、発酵タンクは酸アルカリ溶液を自動的に添加し、pH値を必要な範囲内に正確に維持することができる。細胞成長段階でpH 5.0-6.0を維持し、発現段階を3.0-5.0に調整することを誘導し、この正確なpH制御は酵母細胞内酵素の活性を維持し、細胞の正常な成長と代謝を促進し、同時に外因性蛋白質の分解を減少し、蛋白質の生産量と品質を高めることに役立つ。

溶存酸素レベルの制御も発酵タンクの重要な機能の一つである。畢赤酵母は発酵過程において溶存酸素に対する需要が高く、発酵タンクは合理的な通気システムと攪拌装置を通じて、溶存酸素濃度が常に＞20%のレベルに維持されることを確保した。通気システムは発酵液中に空気または酸素を均一に通液することができ、攪拌装置は絶えず攪拌することによって、酸素を発酵液中に十分に分散させ、酸素の伝達効率を高め、異なる成長段階におけるピカピカ酵母の酸素に対する需要を満たし、その代謝活動の正常な進行を保証し、さらに外因性蛋白の効率的な発現を促進する。

攪拌と通気システムの協同作用は発酵液中の栄養物質の均一な分布を保証することができて、局所的な栄養不足あるいは過剰な情況が出現することを免れて、すべてのピカピカ酵母細胞を良好な栄養環境の下で成長させることができます。同時に、発酵タンクの密封性能も非常に重要であり、それは外界雑菌の汚染を防止し、ビフィズス酵母の発酵過程の清浄性と安定性を確保し、菌染めによる発酵失敗や生成物の品質低下などの問題を回避することができる。

錦維生工の発酵タンク製品はまさにこれらの重要な需要に基づいて設計と製造を行っており、先進的な温度制御、pH調節、溶存酸素制御及び高効率の攪拌と通気システムを有しており、ビヒクル酵母の発酵に最適な環境条件を提供することができ、ユーザーが高効率で安定したビヒクル発酵生産を実現するのを助け、実験室の小試験段階でも工業の大規模生産でも発揮できる性能を提供し、異なるユーザーのビヒクル発酵に対する各種需要を満たし、生物技術産業の盛んな発展を助ける。私たちは引き続き畢赤酵母の研究動態と応用需要に注目し、発酵タンクの設計と製造技術を絶えず最適化し、革新し、発酵タンクの性能と安定性を高め、畢赤酵母の発酵生産により先進的で高効率な設備サポートを提供し、共同で生物技術産業がより輝かしい未来に向かうことを推進する。

錦維生工発酵タンクの紹介
Jimway-be® Labシリーズ----デスクトップ級反応器

Jimway-be® PMシリーズ---多連バイオリアクター

適用例：原核/真核細胞の培養と発酵と発現

シャーレ容積：250 ml/500 ml/1 L/3 L/5 L/10 L

ユニット数：2-16連

培養方法：懸濁&壁貼り

ブレードタイプ：三斜葉、六斜葉、六平葉、半管式、リフトパドルなどの多種の組み合わせ

伝動方式：磁気結合駆動/機械攪拌

制御策略：PID&階段式制御策略（補材、攪拌回転数、温度、通気など）

材料補充制御：正確な材料補充制御（誤差±1 g）

機能の特徴：

インターフェースの簡潔さ：数分で操作を把握し、より効率的に

無人：リモートアクセス、操作、無人化を実現

フォーミュラ機能：フォーミュラをワンクリックで発行し、人員の操作ミスを減少し、品質を高める

データ分析：複数ロットのデータ比較を実現し、Doe&PATを外接して深さ多変数分析を実現し、プロセスデータを最適化することもできる

データ共有：VPNに基づくWEBリリースで、データの安全と設備の安全を保証する情況の下で、モバイル端末（Android、IOS、Windows）の監視と履歴曲線の表示を実現する