著者らは以前、酵母遺伝子のヒト遺伝子代替型変異を識別するためのスクリーニング戦略に成功したが、この戦略は煩雑で2つの抑制子しか同定しなかった（Kachrooら、2015年）。この技術は人工的にコロニーを分離し、それから行う必要があるしぶんたい分離し、また抑制子を同定するには、数百の酵母コロニーを人工的にスクリーニングする必要がある。そこで、著者らは、高スループットを自動化する方法で抑制子プラスミドをスクリーニングするための新しいプロセスを開発した（図1 a）。

著者らは特に非相補的なヒトβ2 c（HsPSMB 7）タンパク質中の阻害子突然変異のスクリーニングに集中しており、これは構成型発現プロテアーゼ体サブユニットである。この方法は、大幅に短縮された時間内に大規模で間違いのないスクリーニングを実現することができる。実験は96ウェルプレート形式で行い、遺伝配列（SGA）またはMM選択法により単倍体特異性変異体を分離し、それにより四分体分離を行う必要がない（Panら、2004年、Kuzminら、2016年）。5−FOA選択を用いたプラスミド依存性測定により、相補的作用がURA 3に基づくプラスミド上の変異人類遺伝子と相関することが確認された。この戦略を用いて、著者らはHsPSMB 7遺伝子中の複数の置換可能な抑制突然変異を得ることに成功した。論文全体において、著者らは常に「機能置換」、「置換可能性」または「置換可能性」という用語を用いて、ヒト遺伝子またはその変異体が酵母相同性遺伝子の機能を補償する能力を指す。このフィルタリングプロセスは、複数の考慮事項に基づいて開発されています。野生型ヒトPSMB 7（β2 c）は同源の酵母β2遺伝子ScPUP 1に代わることができず、酵母遺伝子を選択的に除去した際に観察された致死的表現型から証明された（図1 b、補足図1 b）（カホロなど、2015年）。対照的に、ヒト遺伝子（またはその変異体）が宿主遺伝子の機能を置換することに成功すれば、菌株は成長でき、機能置換の簡単な検出指標となるだろう。誤り率の高いPCR戦略は、URA 3標識を有する酵母発現ベクター中にHsPSMB 7突然変異遺伝子バンクを生成し、各遺伝子には平均1〜4つの突然変異がある（図1 a）。

任意の突然変異PSMB 7対立遺伝子が同源酵母遺伝子の削除による致死性を補うことができるかどうかを決定するために、著者らは突然変異遺伝子バンクを酵母二倍体HetKO PUP 1/pup 1Δ：：：kanMX菌株（Panら、2004年）に転化した。変換スキームは、互いに分離された数千の酵母コロニーを得るために拡張され、各コロニーは異なるPSMB 7突然変異遺伝子プラスミドを運ぶ（図1 b）。QPix 460を用いて数千のコロニーを自動化的に選択し、96ウェルフォーマットでプレ胞子化GNA培地に播種し、G418 の選択法は、kanMXマーク付きpup 1Δをフィルタリングする。胞子形成後、MM培地（Leu、Arg、His、Ura、CANを含まない）において、異なるヒトPSMB 7対立遺伝子を持つ生存可能なpup 1Δ：：：kanMX単倍体酵母胞子（G 418が存在する場合）を選択することができる（図1 c、底面パネル）。著者らはまた、胞子形成効率の内部対照として、MM培地（G 418を含まない）上での野生型PUP 1単倍体胞子の成長状況（図1 c、上部パネル）を試験した。スクリーニングの結果、MM+G 418培地上に成長した19個のコロニー（図1 dの代表的な画像）が相補的なヒトPSMB 7変異体を運ぶ可能性があることが明らかになった。次いで、これらの単倍体阻害変異体を試験して、抑制がプラスミド中のヒト突然変異遺伝子を運ぶことに起因するかどうかを決定した。酵母細胞のプラスミド依存性は、5−FOAの欠乏成長（これはURA 3遺伝子を抑制する）に基づいて試験される。これら19個の抑制変異体のうち7個は5−FOA培地上で生存できず、これらの菌株中のヒト遺伝子変異体が生存に必要であることを示している（図1 d）。

理想的には、酵母菌をヒト化してヒト遺伝子を機能的に特徴づけることは、酵母菌中の野生型ヒト対立遺伝子を利用することになる。しかし、抑制子スクリーニングおよびc末端末尾交換データは、ヒトβ2 cが酵母CPに正しく組み込まれるためには、変異と隣接する酵母サブユニットとの相互作用、特にScβ3を必要とすることを示している。したがって、これらのヒト特異的サブユニット相互作用を回復するための戦略は、野生型HsPSMB 7を酵母プロテアーゼ体に統合する可能性がある。この仮説を検証するために、著者らは野生型ヒトβ2 cが菌株中の酵母対応物を機能的に置換できるかどうかを尋ねた。著者らはCRISPR−Cas 9に基づく方法を開発して酵母のScPUP 1（β2）とScPUP 3（β3）遺伝子を標的にした。Cas 9-sgRNAScPUP 1またはCas 9-sgRNAScPUP 3を発現するプラスミド形質転換酵母は、その死を招く。もしヒト遺伝子が酵母のどうげんいでんしでは、対応する酵母部位5'と3'末端相同配列を含むヒト遺伝子修復テンプレートを共転化し、生存する細胞が得られることが予想される。

著者らはまず、野生型HsPSMB 7がScPUP 1の代わりにその場遺伝子サイトで機能するかどうかをテストしたが、予想通り生存しているコロニーは得られなかった（図2 a）。しかし、T 44 AまたはS 214 G変異を有するHsPSMB 7変異体を用いて、修復テンプレートは酵母のPUP 1遺伝子を機能的に置換することを可能にする（図2 b）。著者らはこれまで、酵母のβ3（PUP 3）遺伝子がプラスミド上で発現されると、そのヒト相同性遺伝子（HsPSMB 3）によって機能的に置換されることを証明してきた（Kachrooら、2015年）。HDRベースのCRISPR-Cas 9戦略（アフメトフら、2018年）を用いて、著者らは解析型酵母のβ3遺伝子をヒトのβ3（HsPSMB 3）遺伝子に置き換えることに成功した（図2 c）。そのため、酵母のβ2サブユニットはヒトのβ3サブユニットを酵母プロテアーゼ体コア部位に募集することができるが、ヒトのβ2 cサブユニットは酵母のβ3サブユニットと共同でその役割を果たすことができない。まず、ヒト化されたβ3酵母株を用い、CRISPR−Cas 9の遺伝子編集技術に基づいて酵母中のβ2を野生型のヒトβ2 c（HsPSMB 7）遺伝子に置き換えることができるようになった。二重化Hsβ2 c−Hsβ3酵母株は生存可能であり、これは部位特異的PCRとサング配列決定検証された（図2 d）。

したがって、通常相補的でないヒトβ2 cは、隣接するヒトサブユニット、すなわちヒトβ3を提供することによって酵母プロテアーゼ体において現在機能することができる。しかし、酵母においてヒトβ3を提供することは、酵母β2をHsβ2 iによって相補的にすることはできない。定量成長測定は工事菌株の適度な適応性欠陥を示した。人化Hsβ2 c−S 214 G菌株は23°Cで低温敏感な成長欠陥を示し、人化Hsβ2 c−T 44 A菌株は23°Cと37°Cで野生型菌株より成長速度が遅い。また、ヒト化Hsβ3菌株は野生型酵母の成長と同等であるが、ヒト化Hsβ2 c−Hsβ3菌株は23°Cで低温敏感な表現型を示し、液体培養では30°Cで成長速度が遅い。