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Meigu Molecular Instrument (Shanghai) Co., Ltd
バイオセンサ「プローブ」、大腸菌L-トレオニン収量向上
日付：2025-09-15読み：0
L-トレオニン必須アミノ酸として、飼料、食品、医薬分野で需要が旺盛である。システム代謝工学はすでに大腸菌のL-トレオニン生産効率を120 g/Lを突破させたが、代謝ネットワークが複雑で、標的が探しにくいため、効率と生産率を両立することが困難である。そのため、菌株の進化を加速させるためには革新的で効率的な方法が必要である。
「バイオセンサーと代謝ネットワークの最適化戦略を組み合わせて、l?threonineの生産を強化します。エシェリチャ コリ」は2025年3月に江南大学饒志明チームが発表したバイオ燃料およびバイオ製品のためのバイオテクノロジー前の記事。本研究はL-トレオニン生産菌の生産能力をさらに高めるための一連の工程戦略を提案した。
まず、大腸菌に外因性L−トレオニンを誘導できるプロモーターを転写群分析を用いてスクリーニングした。
その後、CysB変異体とeGFPを結合することにより、L-トレオニン濃度の変化に敏感に応答できる蛍光報告システムを構築した。
次に、このバイオセンサを用いてFACSとQPixの二段階高フラックススクリーニング技術を支援し、菌株の反復進化を実現し、優良な変異体を捕獲する。
さらに、多群学的分析により有益な標的を同定し、GSMNにより細胞内炭素フラックス分配を最適化してL−トレオニン収量を最大化する。
本研究は工業応用の潜在力を持つL-トレオニン高収率菌株を開発しただけでなく、高感度L-トレオニンバイオセンサを構築する新しい方法を示した、他の化学品に対するバイオセンサの開発に新たな構想を提供した。
図1：プロセスの概要
結果と議論
結果と議論
L-トレオニン濃度の変化に応答する内因性遺伝子のスクリーニング
高感度L-トレオニンバイオセンサを開発するために、研究者はまずMG 1655に0-60 g/L外因性トレオニンを適用し、転写グループ学的分析を行い、32個の発現量とトレオニンに正相関する遺伝子をスクリーニングした、さらに21個のプロモーターに焦点を当ててeGFP報告ライブラリーを構築した後、PcysK応答が最適で線形であることを確認したが、天然要素の閾値が狭く、偽陽性が高く、後続の最適化が必要である。
図2：L-トレオニンバイオセンサの掘削、設計と特性評価
センサを改造してL-トレオニンへの応答を高める
天然センサの感度が低く、閾値が狭いという欠陥を克服するために、「cys」シリーズプロモーターの人工改造を研究する：
CysB結合部位を削除すると、L-トレオニン応答は完全に消失し、CysBが必要な制御因子であることを確認した。
その後、より感度の高いpTrc 99 A-PcysK-egfpプラスミド中でCysBを過発現し、「pSensor」を構築し、その線形区間は0-4 g/Lに圧縮され、感度は2.1倍向上した。
分子ドッキングと定点突然変異ロックCysB-T 102はキーポイントであり、T 102 A突然変異体「pSensorThr」の応答閾値はさらに2.4倍上昇し、高収量（THR 36-L 19）と無収量（THR 01）菌株を確実に区別することができる。
既存のシステムに比べてpSensorThr誤ふるいのリスクは低いが応答範囲は狭いため、さらに応答範囲を最適化して適用性を拡大する必要がある。
図3：L-トレオニンバイオセンサの開発、テスト、最適化
図4：pSensorThrバイオセンサの開発
高スループットスクリーニング支援L-トレオニン高収率菌株の同定
温度感受性突然変異プラスミドMP 6 tsをTHR 36-L 19に導入し、30°Cで変異を誘発し、42°Cでプラスミドを除去し、迅速に大規模突然変異ライブラリーを構築した、その後、pSensorThrを導入し、FACS、QPix高フラックススクリーニング装置を用いて5回の「突然変異−スクリーニング」サイクルを行い、合計50株の多収量蛍光突然変異株を抽出した。フラスコ検査では、多くの菌株の生産量が出発菌より優れており、そのうちTHRM 1の生産量が最も高く、38.97 g/Lに達した。
図5：pSensorThrバイオセンサの応用
QPixは菌株スクリーニングにおいて菌選別の標準化/解放手作業/高効率菌選別の役割を果たした。
多群学的に指導された逆代謝工学はL-トレオニン生産量をさらに向上させる
THRM 1の高収量は「TpxC 61 G」と「Spot R 290 H→H 290 R回復」の2つの突然変異に由来する：収率上昇≒3%。また、tpxまたはspoTをノックアウトしてそれぞれ微増または深刻な降下を行い、両者の作用を確認した。残りの4つの突然変異は顕著な寄与がなかった。転写群はTHRM 1重調炭素流を示した：EMPとアセトアルデヒド酸経路の引き上げ、TCAの引き下げ、pps高発現補充PEP、しかし、pykF、poxB、pflBの過剰発現は炭素流失をもたらした。この3遺伝子を順次ノックアウトし、THRM 6の生産量は41.36 g/Lに上昇した。これらの発見は重要な遺伝的標的を明確にし、後続のさらなる収量向上にも方向を提供した。
図6：多群学分析に基づく逆代謝工学解析L-トレオニン高収量機構
図7：コンピュータシミュレーションによる新しい代謝工学的標的の予測
概要
まとめ
本研究は高感度、高蛍光閾値のバイオセンサを開発し、高フラックスプラットフォームの優れた突然変異株のスクリーニングに用いた。多群学的分析指導による逆代謝工学とコンピュータシミュレーションにより、工学菌株THRM 13は5 L発酵槽中で163.2 g/LのL-トレオニン生産量に達し、糖酸転化率は60.3%となり、これまで外因誘導剤と抗生物質を使用しない条件下で報告された最高レベルとなった。また、この高スループットスクリーニング戦略は、菌株の後続の反復進化に引き続き使用することができる。
QPix FLEX微生物クローンスクリーニングシステム
参考文献
Zhenqiang Zhao1,2は？Rongshuai Zhu1,2は？ 、Xuanping Shi1,2、Fengyu Yang1,2、Meijuan Xu1,2、Minglong Shao1,2、Rongzhen Zhang1、Youxi Zhao3、Jiajia You1,2 *およびZhiming Rao1,2 *。バイオセンサーと代謝ネットワークの最適化戦略を組み合わせて,強化されたl?Escherichia coliにおけるトレオニンの生産バイオ燃料およびバイオ製品のためのバイオテクノロジー（2025年） 18:37.
美谷分子計器について
Molecular Devicesは1980年代に米国シリコンバレーで創業し、世界に複数の代表処と子会社を設立した。2005年、Molecular Devicesは上海に中国代表処を設立し、2010年に世界の科学と技術の革新者である丹納赫グループに加入し、2011年に正式にビジネス会社：美谷分子計器（上海）有限公司を設立した。Molecular Devicesは持続的な革新、迅速で効率的、高性能な製品と完全なアフターサービスで知られており、私たちはお客様に生命科学研究、製薬及び生物治療開発などの分野でタンパク質と細胞生物学の革新的な生物分析ソリューションを提供することに力を入れてきました。
