一、限外ろ過遠心管遠心パラメータ最適化

回転速度と時間

最初の遠心分離は、推奨回転数の70%で開始し（例えば、3000×gを10分間遠心分離した）、流速を観察した後、4000×gに段階的に調整することを提案したが、ろ過膜の耐用限界を超えてはならない。

典型的な処理時間は、滞留分子量（MWCO）及びサンプル体積に応じて10〜30分である。

おんどせいぎょ

遠心機は4℃まで予冷し、熱変性吸着を減少させる必要がある。低温環境は膜の寿命を延ばすことができるが、濃縮時間が長くなる可能性があることに注意する必要がある。

加速度と平衡

遠心加速度を最低段に調整し、膜への圧力を減少させる。

ペアリングされた限外ろ過管の品質と重心のバランスを確保し、ろ過コアの配置位置と方向が一致し、遠心中の揺れや損傷を避ける。

二、回収率向上戦略

ろ過膜選択と前処理

目標分子量に応じてMWCOが目標分子より2〜3倍小さい限外濾過膜を選択した。例えば、標的タンパク質分子量が35 kDaの場合、10 kDaの分子量を遮断する限外ろ過管を選択する。

新たに購入した限外ろ過遠心管の限外ろ過膜は微量グリセリンを含み、使用前に純水または緩衝液に浸漬し、冷蔵庫に10分間予冷する必要がある。その後純水を注ぎ、さらに限外ろ過管を氷上に2〜5分間予冷した。

サンプル処理とサンプリング

試料は事前に0.22μm濾過膜で濾過し、粒子状物質が限外濾過膜に詰まらないようにした。

サンプルをゆっくりと限外ろ過管に加え、液面は最大標識線を超えない。サンプリング時の操作は軽く、膜構造を破壊しないようにしてください。

濃縮と溶出

遠心分離中は5分ごとに一時停止し、ピペットで遮断層を軽く吹き付け、高分子堆積による濃差分極層の形成を防止した。

保持体積は、元のサンプル量の1／10〜1／20に制御される。濃縮倍数が高すぎるとタンパク質の凝集を招きやすく、限外ろ過の途中で緩衝液を添加して置換し、段階的に濃縮することができる。

粘稠サンプル（グリセリンやショ糖を含む）については、回転速度を10〜20%下げ、遠心時間を延長する必要がある。

リカバリオペレーション

遠心分離後、高分子は上層に残り、小分子と溶媒は膜を通じて下層に入る。外管濾液は小分子物質と溶媒である、内管液体は高分子物質である。

高分子物質を収集する必要がある場合は、外管を別に取り、内管を1000×g反転させて1〜2分間遠心分離する。

三、よくある問題と解決方案

蛋白質漏れまたは蛋白質が検出されない

原因：ろ過膜の選択が不適切、遠心パラメータが不適切、サンプル初期濃度が低すぎるなど。

解決策：適切なMWCOろ過膜を再選択し、遠心パラメータを調整し、試料の初期濃度が25μg/mlより大きいことを確保する。

膜詰まりや流速が遅すぎる

原因：サンプル中の粒子状物質の多さ、ろ過膜汚染など。

ソリューション：サンプルを事前に濾過し、定期的に濾過膜を洗浄または交換する。膜詰まりが見つかった場合は、0.1 M NaOHを1時間浸漬し、純水で3回洗浄した。

回収率が低い

原因：ろ過膜吸着性、操作不適切など。

解決方案：事前に1%BSAで濾膜を30分間閉鎖し、非特異的吸着を減少させる。操作時は膜構造を破壊しないように柔らかさに注意する。

限外ろ過後の貯留液の沈殿

原因：蛋白質濃度が高すぎ、Bufferが不適切など。

解決方案：複数本の限外ろ過管を用いて同時に限外ろ過し、濃度を下げる、タンパク質が沈殿しないまで、異なるBufferを交換します。沈殿については、8 M尿素で溶解した後、再び遠心分離することができる。

四、メンテナンスとメンテナンス

洗浄と消毒

使い捨ての限外ろ過遠心管は、使用後そのまま廃棄する。

繰り返し使用する場合は、使用済みの限外ろ過管を純水で5回繰り返し洗浄し、さらに0.1 M NaOHで1-2時間浸漬し、その後20%エタノールで洗浄し、そして超純水または緩衝液で3回洗浄する。一般的に、限外ろ過管を5回以上繰り返し使用することは推奨されていません。

長期保存

短期保存：0.1 M NaOHで1-2時間浸漬し、純水で3回洗浄し、その後75%エタノールで浸漬し、必ずろ過膜を湿潤させ、菌を成長させることはできない。

長期保存：0.1 M NaOHで1-2時間浸漬し、純水で3回洗浄し、その後20%エタノールで浸漬し、必ずろ過膜を湿潤させ、菌を成長させることができない。