超微量核酸定量分析器(例えば超微量核酸蛋白測定器)による蛋白質の試験は主に紫外−可視分光光度法に基づいており、特定の波長(例えば280 nm)における蛋白質の吸光度を測定することによりその濃度を推定する。次に、タンパク質をテストするための具体的な方法と重要なステップを示します。
一、テスト原理
タンパク質分子中のトリプトファン(Trp)、チロシン(Tyr)残基及びCys−Cysジスルフィド結合は280 nm波長で顕著に吸収された。計器は280 nmにおける蛋白質溶液の吸光度(A 280)を測定し、ランベルト・ビルの法則を結合し、直接蛋白質濃度(mg/ml)を計算した。この方法では、標準曲線を構築する必要はありませんが、サンプルに280 nmで吸収された他の不純物(核酸、フェノールなど)が含まれていないことを確認する必要があります。
二、操作手順
計器の準備
電源を接続し、機器を起動し、5~10分予熱して安定した状態にします。
「タンパク質A 280」検出モードを選択し、光路を設定します(通常は10 mmですが、機器が自動的に調整する可能性があります)。
高純度蒸留水またはブランクバッファを用いてゼロ点較正を行い、背景干渉を除去した。
サンプル処理
試料量:2μL試料(一部の機器は0.5-2μL微量検査を支持する)を使用し、安定液柱の形成を確保することを提案する。
気泡を避ける:サンプリング時に検出孔の底部に軽く触れ、ゆっくりと液体を放出し、気泡が吸光度測定に影響することを防止する。
表面張力:サンプルの表面張力が低い(例えば洗浄剤を含む)場合、サンプル量を4μLに増やして液柱の安定性を保証することができる。
ブランクコントロール
2μLの空白溶液(緩衝液など)を取って下基台に加え、上基台を置いて「空白」ボタンをクリックし、背景吸光度を記録する。
ベースを拭き、残留液がないことを確認します。
サンプル検査
2μLの測定対象サンプルを下ベースに加え、上ベースを置いて「サンプル」ボタンをクリックします。
器具は吸光度を自動的に測定し、濃度を計算し、結果は通常mg/ml単位で表示される。
高濃度サンプル:吸光値が計器レンジ(例えば光強度<200)を超える場合、サンプルを希釈して再検査する必要がある。
データ記録とクリーンアップ
検出結果を保存し、CSVまたはPDF形式にエクスポートします。
基台を無塵布で拭き、交差汚染を避ける。
三、重要な注意事項
ベースライン較正
デフォルトのベースライン較正波長は340 nmで、ユーザーは必要に応じて調整することができます。
試料の検出前にキャリブレーションを完了しなければならない。そうしないとスペクトル値がずれ、濃度計算ミスを招く。
サンプル純度
試料中に核酸、フェノール類または高濃度塩イオンが含まれることを回避し、これらの物質は280 nmで干渉吸収を生じる可能性がある。
不純物含有試料を検出するには、BCA、Bradford法などの比色法と組み合わせるか、2波長(280 nm/340 nm)を用いて背景を差し引くことができる。
けいきほしゅ
光源:長時間露光を避け、使用しない場合は光源を閉じて寿命を延ばす。
モノクロメータ:シリカゲルなどの乾燥剤を定期的に交換し、分散要素が湿気によってカビが発生するのを防止する。
検出器:強い光の直射や湿気による塵の蓄積を防止し、清潔を維持する。
環境:機器は乾燥、安定したテーブルの上に置き、エアコンの吹き出し口や直射日光から離れ、温度は25℃±2℃に制御する。
特殊サンプル処理
凝縮サンプル:45度斜面壁貼りを用いてゆっくりと荷重し、オーバーフローやニュートンリング干渉を防止する。
多糖類物質:検査後にエタノール試薬で液路を洗浄し、残留を避ける必要がある。
油脂サンプル:浮上現象が発生する場合、低温遠心分離してから検査する必要がある。
四、応用シーンと優勢
迅速定量:複雑な前処理を必要とせず、2-5分以内に検査を完了し、高スループットスクリーニングに適している。
微量検査:0.5-2μLサンプルだけが必要で、貴重なサンプル(例えば臨床標本、希少蛋白)を節約する。
多パラメータ分析:一部の計器はA 260(核酸)、A 280(蛋白)及びOD 600(細菌濃度)の同時検出を支持し、多成分定量を実現する。
携帯性:現場検出やモバイルラボに適したコンパクト設計。