液滴に基づく微小流体技術を用いたDNA配列決定

液滴生成技術は研究者が最小サンプル量を用いて大規模な研究を行うことができ、この方法はDNA配列決定をより効率的かつ経済的にすることができる。また、がん診断に関連する単細胞内の微小変異の識別にも役立ちます。本文はDNA分析における液滴生成の応用を討論し、液滴微小流体を用いた実験に必要な基本的な設置を示した。

1 DNA分析のチャンスと挑戦

科学者はDNAを分析し、癌の突然変異を識別し、ヒト抗体を特徴づけ、微生物を区別するなどした。DNA解析は、既知の配列プローブ配列を使用したり、次世代シーケンシング（NGS）プラットフォームを用いてゲノムをシーケンシングしたりするなど、さまざまな技術に関連している[1]。

NGSプラットフォームはチップアレイを利用して大規模な並列分析を実現し、数億個の分子を同時に検出することができ、それによってコストを削減し、効率を高めることができる[1]。

しかし、従来のチップアレイの分析能力は制限されており、追加の流体処理と試薬混合システムが必要であり、実験プロセスの複雑さを高め、総スループットを制限している。塩基当たりの配列決定コストを削減するためには、通常、複数のサンプルを並列処理する必要があるが、バーコードマーカーはこの問題を部分的に緩和することができるにもかかわらず、実験プロセスの時間を増やしている[1]。

2 液滴に基づく微小流体技術

マイクロ流体制御液滴技術は、混和性のない相（通常は水相と油相）を用いて離散液滴を生成し、マイクロ流体制御ポンプを介して液滴の生成を高速かつ正確に制御するものである[3]。主なメリットは次のとおりです。

• 低サンプル体積要件

• 高い自動化レベル

• ハイフラックス

• 低コスト

・マイクロ流体制御装置は流体体積を迅速、正確に制御し、DNA分析スループットを高めることができる。例えば、液滴マイクロフロー制御技術は、毎秒数千個の液滴の生成と選別を実現することができる[1]。

各液滴は独立した反応室であり、デジタルPCR分子計数、蛋白質結晶スクリーニング、遺伝子発現分析などの応用に適している。反応回数は液滴生成速度の増加に伴って拡大することができ、同時に液滴体積の減少は試薬消費を低下させ、実験をより柔軟性を持たせることができる[1]。

全体的に言えば、この技術は非常に少ない試薬消費の下で数億回の反応を行うことができ、実験効率を大幅に向上させ、コストを削減することができる。しかし、チップアレイに基づく固定点検出とは異なり、液滴はマイクロフロー制御チャネルを流れ、位置情報によって反応結果をマーキングすることができないため、追加のマーキング方法が必要である[1]。

3 高スループット単細胞ゲノム配列決定

伝統的な配列決定技術は通常、ゲノム中の微小な変異を検出することが困難であるため、科学者は単細胞全ゲノム配列決定を利用してコピー数変異と単ヌクレオチド変異を識別する[2]。

マイクロフロー制御技術により、高スループット、拡張可能な単細胞配列決定を実現することができる。例えば、1つの研究はバーコードマーキング技術を用いて、単一癌細胞の増幅ゲノムDNAを分析する。この方法は癌緩和期に病原性突然変異を有する細胞を検出し、急性髄系白血病（AML）腫瘍の複雑なクローン進化過程を明らかにすることができ、これらの情報は伝統的な配列決定方法では捕捉できない[3]。そのため、この技術はがんゲノムの異質性分析の精度を高め、個性的な治療戦略を最適化することが期待されている[3]。

4 どうやって実験を始めますか。

液滴マイクロフロー制御技術は、高スループット、低コストのDNA分析方式を提供する。関連する実験を行う場合は、以下に必要な基本デバイスを示します。

マイクロフロー制御ポンプ2-3台（または4 Uポンプのような2〜3チャンネルを備えたポンプ1台）――連続相（油相）と分散相（水相）の流れを制御する。4 U圧力ポンプまたは2-3台のExiGoマイクロフロー制御注射ポンプを使用することを推奨し、その中の4 U圧力ポンプは4つの通路を独立に制御でき、安定かつ正確な流量制御を実現する。

• 2～3フローセンサ――油相と水相の流量をリアルタイムで監視し、流体の安定を確保する。

• マイクロフロー制御チップ――液滴を生成し、液滴サイズの制御性を保証する。

• 安定したチャネル表面化学修飾――液滴の安定性を高める。

• 界面活性剤——油水界面を安定させ、液滴の安定性を強化する。

• ゆそう――液滴の安定性を高める。

• かんろ――ポンプとマイクロフロー制御チップを接続する。

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参考文献

1. Abate, Adam R et al. “ドロプレットベースの微流体学でDNA配列分析。” チップボリュームのラボ. 13,24 （2013）: 4864-9.ドイ:10.1039/c3lc50905b

2. Pellegrino、Maurizio等。 “ドロプレット微流体による急性骨髓性白血病2 2 2 2. 高スループットシングル細胞DNA配列。” ゲノム研究vol. 28,9 （2018）： 1345-1352.ドイ:10.1101/gr.232272.117

3. Sohrabi、S.＆Moraveji、M.K.（2020）。ドロプレット微流体学：基礎とその高度なアプリケーションRSC Advances, 10(46), 27560-27574。