全自動蛋白免疫印影処理システムが実験中に発生する可能性のあるよくある問題は主に信号が弱いか信号がない、背景が高い、マルチバンド現象、ストライプ異常などを含み、以下はこれらの問題に対する詳細な分析である：
信号が弱いか信号がない
一抗と二抗は一致しない：二抗は一抗宿主の種と同じである必要があり、例えば一抗はマウス由来であり、二抗は抗マウス抗体であるべきである。
抗体濃度不足：高濃度抗体を使用し、4℃条件下で一晩インキュベーションなどのインキュベーション時間を延長する。
封止剤と抗体の交差反応：吐温-20などの温和な洗浄剤を使用するか、封止剤（脱脂粉乳、BSA、血清、ゼラチンなど）を交換する。
一抗不認識対象種のタンパク質：説明書を参照し、免疫原配列とタンパク質配列を比較し、抗体と目的タンパク質が反応することを確保し、陽性対照を設置する。
蛋白質サンプリング量が不足している：1レーン当たりの蛋白質サンプリング量は一般的に20μgを超えず、プロテアーゼ阻害剤を使用し、陽性対照を設定する。
転写膜が不十分：可逆染色剤を用いて転写膜の効果を検出し、転写膜の操作が正しいかどうかを検査し、例えばPVDF膜は事前にメタノールに浸漬し、その後転写緩衝液に浸漬する必要がある。
一抗失効：新鮮な抗体を使用し、再使用による有効濃度の低下を避ける。
二抗アジナトリウム抑制：アジナトリウムとHRP標識抗体の併用を避ける。
キットの有効期限切れまたは基質の不活性化を検出する：新鮮な基質を使用する。
背景の高さ
特異的な閉鎖または閉鎖が行われていない：閉鎖時間を延長し、適切な閉鎖剤の交換を考慮する。
一抗または二抗濃度が高すぎる：抗体を適切な濃度に希釈するか、またはより高い希釈度の抗体でインキュベーション時間を延長する。
二次抗体と封止剤の非特異的結合または反応：二次抗体対照（一次抗体を加えない）を設定する。
未結合タンパク質洗浄が不十分：洗浄回数を増やす。
膜乾燥：インキュベーション中に膜の乾燥を防止し、各ステップは膜に十分な反応液があることを保証し、攪拌子を入れて絶えず攪拌したり、軽く振動したりして膜を溶液に浸すことができる。
膜選択の不適切：硝酸セルロース膜（NC膜）はPVDF膜より背景が低く、実験需要に応じて適切な膜を選択することができる。
マルチバンド現象
細胞の継代回数が多すぎて、蛋白質の発現が違う：原始の継代されていない細胞株を使用して、現在の細胞株と一緒に平行対照実験を行う。
体内で発現されるタンパク質サンプルは、アセチル化、メチル化、アルキル化、リン酸化、グリコシル化などの様々な修飾形態を有し、試薬を用いてサンプルを脱リン酸化、脱グリコシル化して翻訳後の修飾を証明することができる。
タンパク質サンプル分解：サンプル緩衝液に十分なプロテアーゼ阻害剤を添加する。
報告されていない新規タンパク質または同一タンパク質ファミリーに類似のエピトープを有し、構造が異なるタンパク質が検出された：他の文献記事を参照するか、BLASTを用いて検索し、取扱説明書が推奨する細胞株または組織を使用する。
一次抗濃度が高すぎる：抗体濃度及び／又はインキュベーション時間を低下させる。
ストライプ例外
背景には不均一な白色斑点がある：膜を回転する時に膜上に気泡があるか抗体が膜上に不均一に分布し、膜を回転する過程でできるだけ気泡を除去し、抗体の孵化時に揺動を維持しなければならない。
背景には黒い斑点がある：抗体は封止剤を結合し、封止剤を濾過することができる。
深い背景に白色帯が現れた：一抗または二抗が多すぎて、抗体の濃度を希釈すべきである。
目的：帯染色は低/高すぎ、分離は徹底していない：ゲルの割合を変え、分子量の大きい蛋白質は低濃度ゲル、分子量の小さい蛋白質は高濃度ゲルを用いる。
ストリップ「微笑み」効果：移動が速すぎるか、電気泳動温度が高すぎるとpH値と移動速度が変化し、移動速度や低温電気泳動（冷凍庫や氷の上で行うなど）を低下させることができる。
同じ蛋白質ハイブリダイゼーションに不均一なストリップが現れた：ゲルを製造する時にゲルの凝固が速すぎて、水路の中のアクリルアミドの割合が不均一になって、ゲルの調合方法を参照して、ゲルの中に適量のTEMEDを添加して、放置する時にゲルの頂部に適量の1%SDS（水希釈）を添加してゲルの乾燥を防ぐことができる。