近赤外蛍光共焦点顕微イメージングシステム

生物医学、材料科学、光電子デバイス及び生物医薬工学などの科学研究分野において、目標サンプル（例えば生体小動物深層組織、NIR-II量子ドット/ペロブスカイトマイクロナノ構造、生物標的蛍光プローブ標識細胞）は常に動的進化、多構造を呈する階層的かつ組織イメージング深さ、材料発光均一性、プローブターゲット効率などの環境に敏感な複雑な特徴と空間分布、時間動態、光-物質相互作用は密接に結びついている。従来の単一イメージング技術では、単次元からしか情報を得ることができず、突破することができなかった 「浅層撮像限界」 と 「高背景干渉」 の二重ボトルネックであり、全面的に解析できないNIR-II帯域には深層、高分解能イメージングのニーズがある。そして、近赤外二領域蛍光共焦点顕微イメージングシステムは統合によりNIR-II帯域優位性、共焦点空間分解能力とその場動態モニタリング機能は、試料のサブミクロン微細構造から数ミリ深層組織までの全方位イメージング解析を実現し、すでに突破となったNIR-II関連する複雑なシステムがボトルネックを研究する核心技術。

いかなる非NIR-II帯域の撮像技術または非共焦点モードには、深層撮像能力と空間分解能の固有の限界があり、サンプルの一部の属性を反映するだけで、完全に捉えることができないNIR-II分野のコア研究ニーズ。例えば、可視光共焦点イメージングはサブミクロン空間分解能を備えているが、生物組織の可視光に対する強い散乱と吸収のため、貫通深さは数百ミクロンにすぎず、マウスの脳、肝臓などの深層組織をカバーすることは困難である、NIR-I蛍光イメージング（700～900nm）貫通深さはわずかに向上しているが、組織汎周波数吸収、背景雑音が顕著で、腫瘍境界と正常組織をはっきり区別できない、ふつうはばNIR-IIイメージングは利用できるが 「バイオ光学ウィンドウ」（1000〜1700nm）数ミリ貫通を実現したが、共焦点の空間クロマトグラフィー能力が不足し、深層組織中のサブミクロン構造（例えば毛細血管分岐）を位置決めできなかった、過渡蛍光イメージングは発光動力学を捕捉することができるが、関連付けられないNIR-II帯域のある深層空間分布 —— これには、近赤外二領域蛍光共焦点顕微鏡撮像システムを用いて、 “NIR-IIバンド低散乱+共焦点高分解能」 の協同優位性を補い、深層、高分解能イメージングの重要な空白を埋め、Z大化とその他の技術の相補性。（参考文献：Schmidt et al.、Nat Rev Methods Primers 4, 23 (2024).）

図1. 近赤外二領域蛍光イメージング

光学情報検出の分野では、近赤外2領域蛍光共焦点顕微イメージングシステムは常にその場環境制御（温度、湿度、ガス雰囲気、生体生体試料に適合）と多モードデータとの関連付け（蛍光強度、空間トモグラフィー画像、時間分解発光信号の同時収集）機能を集積し、高開口数NIR-II専用対物レンズ集束励起光、ピンホールろ過背景雑光、統一空間で確保-深さ座標系下で同時にサンプルの三次元蛍光分布と動的進化データを取得し、伝統的な段階的検出における効果的な回避 「試料変位による構造転位」「環境変化による蛍光消光」 などの質問があります。生体組織対NIR-II光の散乱と吸収は可視光の1/10-1/5、そしてこのシステム低装備光毒性（組織光損傷の低減）、リアルタイム解析可能 「光NIR-IIプローブ-生体組織」 の次元横断相互作用機構 —— 例えば、生体マウスの脳イメージングにおいて、数ミリの深さでの毛細血管管径、血流速度分布を明確に示すことができる、にNIR-IIりょうしドットマイクロナノ構造キャラクタリゼーションにおいて、サブミクロンの位置決めが可能レベル領域の発光欠陥がある。このようなその場融合戦略は、NIR-IIマイクロナノ材料の界面発光機構、生物組織の生理機能（例えば腫瘍血管新生）などのミクロ機構の研究は直接証拠を提供し、また 「動的モニタリング+深層クロマトグラフィー」 技術の結合は、腫瘍微小環境とプローブ相互作用などの複雑なシステムのスケールを超えた作用規則を明らかにするためにコア方法学の基礎を築いた。

近赤外二領域蛍光共焦点顕微イメージングシステムのコア価値は、 “NIR-IIバンドメリット+共焦点分解能」 の共同応用、更にそれが生み出す スペース-深さ-時間」 多次元イメージングデータの深さ結合とインテリジェント解析。この融合は伝統的なイメージング技術を突破した 「浅いレイヤ制限」「解像度」-貫通深さのトレードオフ」 の 「データアイランド」 問題、構築を通じて 「サンプル空かんぶんぷ-深層組織の応答-時間動的進化」 のスケーリング関連モデルを用いて、複雑なシステムに対するホログラフィー化認知を実現した —— 例えば、腫瘍診断において、腫瘍境界の空間位置、深層血管の血液供給状態及びプローブの標的を同時に取得することができるほうこうけつごう効率性にNIR-II材料特性化において、マイクロ領域発光強度と結晶構造の均一性を関連付けることができる。特に現在の人工知能と深さ学習の急速な発展を背景に、このシステムが生成した大スループットイメージングデータ（例えば生体組織三次元蛍光スペクトル、材料微小領域発光動態曲線）と深さ学習アルゴリズムを結合し、腫瘍領域の自動識別、血流力学パラメータの定量分析、NIR-II材料欠陥のインテリジェントポジショニングは、必ず既存を突破する 経験駆動 のイメージングとキャラクタリゼーションの正規形、データ駆動のNIR-II科学研究の新しい段階。

応用例：

1. 時間-空（そら）間-エネルギー多次元解析生物組織の深層動態と分子機構

近赤外2区（NIR-II，1,000〜3,000 nm）帯域低組織散乱、低自己蛍光の固有の利点と時間分解スペクトル及び実空間（rスペース）イメージングを結合し、生体組織へのNIR-II異なる時間遅延、異なる空間位置、異なるエネルギー（波長）における蛍光プローブの発光特性の系統的解析により、プローブ信号と生物過程の依存関係を深く明らかにする。近赤外2領域蛍光イメージングの核心思想は、 「時間遅延」 と 「プローブタイプ/励起パラメータ」 キー変数として、 InGaAs 探知機介（かい）ガイドの広いフィールド/共焦点/フォトチップイメージングシステムと電子ゲートせいぎょじかん異なる条件下の3種類を正確に測定するための分解技術NIR-IIプローブ（無機ナノ粒子、有機分子、遺伝子工学タンパク質）の発光強度、発光波長と空間分布の違い、プローブ信号の構築時間-スペース（t-r空間）における動的分布スペクトル。従来の可視光に比べてNIR-Iイメージング（関心のみ浅い層の静的構造とマクロ光強度）、NIR-II蛍光イメージングはプローブの動的進化（例えば血流速度、薬物除去軌跡）と深層空間定位情報を提供するだけでなく、生体組織内部の光誘起散乱規則、プローブと生体標的の結合効率、及び自己蛍光抑制対信号信号信号信号対雑音比（SNR)のリフトアップ作用があります。（参考文献：Nat Rev Methods Primers 4, 23 (2024).）

図2. 腫瘍中CD8+T細胞（赤色）、アルブミン抗原特異性T細胞（緑色）とpernp の-オバケース-Bシトシン-りん酸-グアニン（CpG B）ナノワクチン（青色）の三次元（3D）再構築NIR-II画像[1]

さらに、時間分解と空間イメージングに基づいてエネルギー軸（E、すなわちプローブ発光波長）であれば、時間遅延（T)、空間位置（r）と光子エネルギー（E）からなる3次元空間（t-r-E相空間）にプロットされたプローブ信号の送信プロファイル、すなわちI （t、r、E)図面。このようなパターンにより、研究者は同時にプローブの時間発展規則（例えば血流最前線移動、リンパ輸送時効）、空間分布特徴（例えば腫瘍標的凝集領域、深層血管分岐）とエネルギー適合特性（例えば発光波長とNIR-IIサブ領域の整合度）、異なるプローブを明らかにする-生体相互作用状態における信号送信の選択的起源。例えば、生体生体組織イメージングでは、異なる時間、空間、エネルギーでのNIR-IIプローブ信号は有意な差を示した：FDA は承認済みICG依尾放出の延長(Emit Extend to)NIRIIa 領域（1300〜1400 nm）、ヒト肝腫瘍手術においてリアルタイムでサブミリメータを位置決めすることができるステージ遷移かまど（空間分解能～2 ミクロメートル)、時間次元で術後を追跡できる 24 時間以内にプローブの肝腎除去動態、NaYbF4：Er希土類ナノ粒子（RENP）放出1550nm NIR-IIb帯域信号、マウスの完全頭蓋骨を貫通した後も維持SNR>10、空間的に脳動脈（赤色）と静脈（青色）分岐をはっきり区別し、エネルギー的に組織散乱に合わせて窓を最小化し、時間的に> 20フレーム＃フレーム＃/秒の動画像化は心臓周期による血流変動を捕捉する、CH-4T@タンパク質複合体放出1000nm NIR-IIリンパイメージングで血管プローブ（DCNP の，1060nm）二色イメージングを形成し、空間的に正確に鼠径溝リンパ節と周囲血管ネットワークを区別し、時間的にプローブの皮内注射からリンパ節への輸送過程を追跡する（~30分達峰）、NIR-II蛍光イメージングは判定に用いることができるRENPために 「深層脳組織イメージング優先プローブ」（適合NIR-IIb低散乱ウィンドウ)、ICGために 「臨床転化優先プローブ」（FDA は属性を承認）、同時に組織自家蛍光の波長増加に伴う減衰規則（>1300nm無視可能）によるSNRリフティング効果。

2. 量子ドットプローブの調製とNIR-II深層バイオイメージング応用

近赤外二領域（NIR-II，1000〜1700nm）蛍光イメージング用低組織散乱、低自家蛍光の独特な優位性は、深層組織の高分解能イメージング分野で巨大な潜在力を示し、生物医学イメージングの重要な研究方向となっている。しかしながら、既存のNIR-II有機染料、カーボンナノチューブ、希土類ナノ結晶などの蛍光団には、量子収率が低く、化学的安定性が悪い、または生体適合性が不足しているという問題が一般的に存在している。けれど PbS 量子ドット（QD）は高い量子収率（到達可能60%）が存在するが、その重金属（Pb²⁺）漏洩毒性、S²⁻酸化しやすいことによる光学安定性欠陥は、生体イメージングへの応用を深刻に制限している。近年、PbS@CdS かくシェルこうぞうQD通過 CDS シェルが初期的に改善されましたPb²⁺問題を漏らし、 シオ₂とFDA は承認済み両親関係ポリマーフルロニック F-127の二層被覆戦略により、材料の化学安定性と生体適合性をさらに向上させることができる——シオ₂層は物理的な遮断を提供して酸化とイオン漏れを抑制し、F-127 の層は水溶性と抗生物吸着能力を付与し、構築により PbS@CdS @ シオ₂@F-127ナノ粒子（NPs の)、突破が期待されるNIR-IIけいこうプローブ“こうど-こうあんてい-低毒性」 両立しにくいボトルネックは、脳血管、胃腸管などの深層組織イメージングに新しい方案を提供する。

本研究では、逆相マイクロエマルジョン法、表面接ぎ木改質及び超音波分散技術を用いて目標量を製造するサブポイントと透過型電子顕微鏡（TEM)、動的光散乱（DLS）、定常状態/過渡蛍光スペクトル、原子吸収スペクトル（AAS）及び InGaAs カメライメージングシステム PbS@CdS @ シオ₂@F-127 NPの真性光学特性、化学安定性及び生体イメージング性能を有し、高い量子収率（~5.79%、多数の既存をはるかに上回るNIR-II蛍光団）、幅pH範囲化学安定性（pH 1～13内（うち）24時間けいこうへんか<30%）、低体外外毒性（UMUC3細胞 10 ミクログラム／mL濃度での生存率> 90%)、および超高速体内除去（胃腸管胃灌漑後4.5時間糞便による排出）などの利点、これらのパフォーマンス向上は、 シオ₂-F-127二層構造の相乗作用——シオ₂シェルは酸素と水を物理的に遮断して抑制するQD酸化、F-127 ののPEGセグメントは蛋白質吸着を低下させ、水溶性を向上させ、両者が形成する緻密な被覆レイヤー有効ブロッキングPb²⁺/Cd²⁺漏れますn型（かた）QD被覆層との界面相互作用により蛍光発光特性が最適化される。（参考文献：ゼビブラ等,アドヴ。機能マター, 32: 2200386 (2022)）

図3. 同じマウスの脳血管を異なる深さで撮影したNIR-II蛍光画像

実験結果は有効に単層を確認した CDS シェルペア PbS かくのほごさようPb²⁺漏洩率）と シオ₂-F-127二層被覆による化学安定性の向上効果は、 PbS@CdS @ シオ₂@F-127 NPNIR-IIイメージング性能：その放出ピークは1155nm（適合NIRIIa 低散乱窓）、マウス脳血管イメージングにおいて実現 950 ミクロメートル 深度の血管ネットワークを明確に可視化し、3D再建画像は軟脳膜毛細血管を識別することができ、胃腸管イメージングでは、 80 ミクログラム／kgの低用量で胃に注入すれば、実現できる3〜5 mm深度の消化器官動態追跡（10分胃の輪郭を示す、4.5時間大腸に達し、糞便とともに排出される）、7 d後体内に残留はなかった。同時に、これらの結果はプローブの実験パラメータ選択を直接指導した：励起波長は785nm（マッチング PbS@CdSQDの高励起効率）、イメージング検出ウィンドウロック1100～1700 nm（励起光迷光を除去する）、ただし、異なるpH条件下の蛍光強度変化スペクトルは二層被覆の化学安定性に直接光学証拠を提供し、生体イメージングにおける蛍光信号の動的発展（例えば脳血管血流変動、胃腸管プローブ移動軌跡）は、この量子ドットの深層組織動態モニタリングにおける信頼性をさらに検証した。

3. 生体適合水溶性短波赤外（SWIR）打ち上げ花シアニン類蛍光プローブの合成と生体乳がん多次元どぶんしイメージングアプリケーション

短波赤外線（SWIR，900〜1400 nm）イメージング用低組織散乱、低自家蛍光の独特な優位性は、深層組織の生体分子可視化の分野で巨大な応用潜在力を示し、特に乳がんなどの実体腫瘍の精確なイメージングに新しい方向を提供した。しかし、現在の臨床および科学研究で利用可能なSWIR蛍光プローブには顕著な限界がある：FDA は承認された近赤外線（NIR）プローブインドールシアニン緑（ICG）まで延びるが、SWIRバンドエミッション、ただし励起波長は800nm以下、モノクロイメージングのみをサポートし、マルチターゲット同期モニタリングのニーズを満たすことができない、その他SWIRカーボンナノチューブ、量子ドットなどの蛍光団は、生体適合性が悪く、水溶解性が不足したり、合成が複雑な問題に直面したりする。近年、ICGの π-共役拡張花シアニン系染料は構造調整性が強く、生物安全性が高いことで注目されており、その中でICG-C9型とICG-C11型より多くの甲川チェーン二重結合数（個別比ICG多 1 個、2 個二重結合）、送信波長の赤方偏移を実現するSWIRコアバンドICG母核の生体適合性基礎は、表面修飾により水溶性最適化を実現することができる。構築によるICG/ICG-C9/ICG-C11基本プローブと抗体、アポトーシスマーカーまたは抗がん剤のカップリングは、協同でSWIRイメージングの優位性と標的識別能力、乳癌表面受容体、腫瘍血管及びアポトーシス過程の多次元解析を実現し、SWIR分子イメージングの臨床転化は新しい考え方を提供する。（参考文献：Mahadeva et al.、ACSアプルお母さんインターフェース,16, 17253−17266(2024).）

図4. インドールシアニン緑（ICG）、ICG-C9型とICG-C11型の光学特性総合的な特徴づけには、吸収スペクトル、蛍光スペクトル、蛍光発光ピークと量子収率及び蛍光発光寿命

本研究では、有機合成、定常状態/過渡スペクトル特性評価及び生体イメージング技術、システムが明らかにしたICG-C9/ICG-C11プローブの固有光学特性と生体イメージング性能は、正確であることが分かったSWIRバンドエミッション1％BSAで指定します。ICG-C9型発射922nm、ICG-C11型発射1010nm)、優れた生体適合性（ヘラ細胞 10 μM濃度での生存率> 90%、体内 4 周肝腎機能指標は正常）及び安定イメージング能力（1％BSAちゅうおうレーザ照射60分ひかりひょうはくりつ< 30%）、これらのパフォーマンス向上は π-共役拡張による波長赤方偏移効果、BSAプローブとの複合作用による安定性の向上、花シアニン母核継承のICG生物安全性。

実験結果は有効に確認されたICG-C9/ICG-C11の π-共役拡張構造とSWIR放出特性の関連付け（増加ごとに 1 個二重結合、発光波長赤方偏移～100nm)、およびNHS のエステル、マレインアシル基イミン、アセチレン炭化水素の3種類の標識試薬と抗体（ヘルセプチン、エルビトックス）、アネクシン V、抗がん剤カドシラの効率的なカップリング能力により、このようなプローブの多色性が明らかになったSWIRイメージング適性 —— 通過785nm（ICG）、905nm（ICG-C9型）、975nm（ICG-C11型）差異化励起と対応帯域フィルタ（900±25nm、1000±25nm、1100±25nm）、乳腺を実現することができる癌HER2／EGFR受容体と腫瘍血管の三色同期イメージング、同時に、この結果はアポトーシスイメージングのプローブ組み合わせ選択（ICG-カドシラとICG-C9/IC11-アネクシンV）及び長期モニタリングの波長パラメータ（ICG-C9-カドシラ採用905nm励起、> 1000 nmプローブ)。そのうち、定常吸収/蛍光スペクトルはプローブを確認した-生体分子結合後の光学特性保持、過渡蛍光衰退曲線（ICG-C9型寿命2.7 ns、ICG-C11型寿命7.1 ns)は、SWIR信号の時間分解識別は必要な光学的証拠を提供し、生体イメージングの信号分布はプローブの標的性を検証する。