蛋白安定性分析器PSA-16（北京佰司特科技有限責任公司）は、中国科学院武漢ウイルス研究所の科学研究者がH 9 N 2インフルエンザウイルスに対するエピトープ最適化型ナノ粒子ワクチンの開発に成功し、2025年6月にチームは「ACS Nano」誌に「Epitope-Optimized Influenza Hemagglutinin Nanoparticle Vaccine Provides Broad Cross-Reactive Immunity against H 9 N 2 Influenza Virus」と題する研究論文を発表した。

エピトープ最適化されたインフルエンザ血凝固体ナノ粒子ワクチンは、H 9 N 2インフルエンザウイルスに対する広範な交差反応性免疫を提供する

PMID:40452158 DOI:10.1021/acsnano.5c03199

要約

H 9 N 2ウイルス（AIV）は世界の家禽業に対して日に日に深刻な脅威を構成し、人類に感染するリスクが持続的に存在している。ワクチン接種はH 9 N 2 AIVの予防と制御の重要な戦略である。しかし、ウイルスの持続的な進化は免疫保護の効率に挑戦し続けている。そのため、広範な免疫反応を引き起こす汎用H 9 N 2インフルエンザワクチンの開発は疫病の予防と制御にとって重要である。本研究は、H 9 N 2インフルエンザウイルスに対する広範な交差反応性免疫を誘発することができるエピトープ最適化ナノ粒子（NPs）ワクチンを報告した。計算アルゴリズムEpigraphを用いて、最適化されたエピトープを有する3つのH 9ヘマトクリット（HA 1）球状頭部を最初に設計した。その後、各抗原はmi 3 NPsと結合し、これら3つの構築物を等モル比で混合してEpigraphワクチンを生成する。Epigraphワクチンはマウスにおいて有効に交差反応性抗体を誘導し、CD 4+とCD 8+T細胞免疫反応を活性化させた。また、このワクチンは多種のH 9 N 2毒株の致死的攻撃に対して有効な保護を提供し、マウス肺部のウイルス積載量を著しく低下させた。本研究は将来のH 9 N 2疫病に対応するために将来性のある汎用ワクチン候補案を提供した。

紹介

H 9 N 2亜型ウイルス（AIV）は1966年に米国ウィスコンシン州の七面鳥から分離され、現在はユーラシア大陸、中東、アフリカ諸国の多種の家禽の中で地方的な流行を形成し、世界の家禽業に深刻な経済損失をもたらし、哺乳動物と人間の中で零細な感染を引き起こしている。1994年に中国で分離して以来、20年以上の伝播と進化を経て、H 9 N 2はH 7 N 9とH 5 N 6ウイルスに取って代わり、中国の鳥類の中の主要なAIV亜型となった。現在、H 9 N 2は適応性突然変異を必要とせずに人間に直接感染し、異なる程度の呼吸器疾患を引き起こすことができる。1998年にヒトのH 9 N 2感染例が報告されて以来、2014年から2016年にかけて、中国の一部の省の職業暴露者のH 9 N 2 AIV血清陽性率は11.20%に達し、鳥類従業員のH 9 N 2感染リスクが顕著に増加したことを示している。

また、2020年以降、ヒトからH 9 N 2に感染した症例数は顕著に上昇している。これまでに150人以上がH 9 N 2 AIVに感染している。システム発育分析により、H 9 N 2ウイルスはヒトH 5 N 1、H 7 N 9、H 3 N 8及びH 10 N 8ウイルス内部遺伝子のドナーであり、新型インフルエンザウイルス株の出現における重要な役割を明らかにした。

最近の研究によると、ほとんどのH 9 N 2ウイルスはヒト型受容体（α2、6シアル酸）と結合する能力を獲得しており、これはH 9 N 2伝播の予防と制御に有効な措置をとる緊迫性を際立たせている。これまで、複数のH 9 N 2候補ワクチンが開発されてきた。しかし、中国のH 9 N 2ウイルスは広範な遺伝子再配置を経験し、新しい遺伝子型の出現を招いた。この持続的な抗原変異は免疫鳥類におけるウイルスの伝播を顕著に促進した。市販のH 9 N 2ワクチンは整合抗原の毒株に一般的に有効であるが、不整合抗原毒株に対する保護効果は限られている。例えば、1997年から2002年にかけて分離されたほとんどのH 9 N 2ウイルスは、代表的なワクチン株SD/6/96と比較して抗原ドリフトを示した。ワクチン株と流行株の不整合はH 9 N 2ウイルスの伝播を効果的に制御することをさらに複雑にし、ワクチン技術を改善し、多種のH 9 N 2インフルエンザウイルスに対する広範な交差免疫を生成する切実な需要を明らかにした。

Epigraphは、すべての潜在的9量体T細胞エピトープのカバレッジ範囲によってワクチン抗原を設計するための効率的な図ベースアルゴリズムである。このアルゴリズムは、治療用HIVワクチン候補物とパンフィラウイルスワクチン候補物の開発に応用されている。Epigraphアルゴリズムを用いて設計されたアデノウイルスベクターワクチンは、豚H 3亜型インフルエンザウイルスに対する強い保護免疫反応を示している。また、計算設計された多価EpigraphヘモグロビンワクチンはマウスモデルにおいてB型インフルエンザウイルスに対する保護効果を示した。このアルゴリズムは、単一抗原または多抗原ワクチン、異なる病原体集団の潜在的なエピトープカバー範囲を効率的に計算し、ワクチン開発を含む抗原設計プロジェクトに適用することができる。

ヘモグロビン（HA）タンパク質はインフルエンザウイルス表面に暴露された糖タンパク質であり、自然とワクチンが媒介する新型インフルエンザウイルス免疫における免疫原性の標的である。HAは細胞表面受容体を結合し、膜融合を誘導することによって感染を開始すると同時に、抗インフルエンザ薬の主要な標的でもある。HAタンパク質球状頭部に位置する受容体結合ドメインは、ワクチン接種後に有効な中和抗体を開始する鍵として決定されている。HAに基づくワクチンの開発には多くの努力がなされているが、サブユニットワクチンの低免疫原性は依然として規制要因である。例えば、計算設計され最適化された変異体i 3？01（mi 3）は抗原免疫原性を増強するためのナノスケールステントとして使用されている。

抗原とナノ粒子とのカップリングは、自発的に結合されたSpyTag−SpyCatcherタンパク質共有結合戦略によって達成することができる。このシステムは顕著な接続効率と安定性を示している。本研究では、3つのエピトープ最適化HA 1タンパク質をSpyTagによってSpyCatcherによって修飾されたナノ粒子に共有結合し、標的タンパク質をナノ粒子表面に容易に付着させることができるようにした。3種類のナノ粒子を混合することにより、Epigraphワクチン候補を設計した。動物実験により、このEpigraphワクチンは効率的で広範な体液と細胞免疫反応を誘導し、異なるH 9 N 2ウイルス株の致死的攻撃に対して十分な保護を提供することが明らかになった。本研究は汎用型H 9 N 2インフルエンザワクチンの潜在的な候補物としてEpigraphワクチンを支持する。

結果

H 9エピトープ抗原の設計と開発

https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/EPIGRAPH/epigraph.html設計が行われ、このツールは、連続する抗原エピトープ長フラグメント（すなわちk−mer当たり）の各々を潜在抗原エピトープと見なすことにより、病原体集団の潜在エピトープカバレッジ範囲をカバーする効率的な図ベースアルゴリズムを採用した。一般的に、k=9は、ほとんどの細胞毒性T細胞I種エピトープの最適な長さであるため、潜在T細胞エピトープ（PTE）の長さに設定される。抗原設計の前に、2022年11月現在の使用可能なH 9 N 2 HA 1配列をGISAIDからダウンロードしました。設計プロセスでは、まずデータセットの各シーケンスを可能なすべての9-merに分解し、サンプルグループ内の各9-merの周波数値（カバースコア）を計算します。次いで、アルゴリズムは、標的ウイルス集団において最も一般的な潜在的9−merエピトープを含むことを確実にするために、最も高い被覆率を有する短い配列（9−mer）から代表的なタンパク質配列（Epigraph 0）のセットを組み立てる。一価ワクチンには、単一抗原で十分である。しかし、カバー範囲をさらに高めるために、アルゴリズムはEpigraph 0によってカバーされたテーブルビットを除去し、第2の補完シーケンス（Epigraph 1）を生成する。このプロセスは、第3の補完シーケンス（Epigraph 2）を生成するために繰り返される。Epigraphシーケンスの数を増やすことで、グループのカバレッジ範囲を高めることができますが、珍しいテーブルビットが組み込まれるにつれて、収益は徐々に減少しています。最終的な3価Epigraph免疫原（Epigraph 0、Epigraph 1、Epigraph 2抗原を混合したもの）は、集団中の潜在的な線形エピトープにカバーを提供する。

3つのEpigraph配列と集団全体との関係を可視化するために、MAFFTを用いて配列をインフルエンザ研究データベースからの6445個のH 9 HA 1タンパク質配列と比較し、最尤（ML）システム発育木を構築した（図1 A）。BLAST照合により、データベースで最も類似した野生型配列を識別した：Epigraph 0-A/鶏/北京/XY 1125/2014（配列一致性：99.7%）、Epigraph 1-A/鶏/安徽/A 3176/2014（配列一致性：90.21%）、およびEpigraph 2-A/鶏/大阪/aq 69/2001（配列一致性：90%）。Epigraphワクチンの効力を評価するために、世界保健機関（WHO）が2018年に推薦した候補不活化ワクチンである現在推薦されている候補ワクチンウイルス（CVV）A/安徽-廬江/39/2018（AL/392018年のヒト分離株）と比較した。

H 9 Epigraph−mi 3 NPの製造と特性評価

TH 9 Epigraph−mi 3ナノ粒子の製造と特性化。ナノ粒子のサイズは免疫反応を励起するために重要であり、それは病原体のサイズと同等でなければ免疫細胞によって効果的に識別されない。したがって、それらはベクターとして、抗原を抗原提示細胞（APC）に効率的に送達し、最適な免疫活性化反応を誘導することができる。本研究では、免疫系の活性化効率を高めるために、抗原として示されるナノスケールのステントとしてmi 3ナノ粒子を用いた。このステントは自己組織化された多孔質十二面体構造であり、60個の同じサブユニットから構成され、多量化ナノ粒子プラットフォームとして、免疫原性の弱い抗原に安全で免疫原性を有するワクチン接種システムを提供する。

SpyCatcher/SpyTagシステムはその簡便性、迅速性及び体外タンパク質の自己組織化を実現する能力のためにタンパク質カップリングに広く応用されている。そこで、SpyCatcherをmi 3のN端に融合させた（図1 C）。図1 D、Eに示すように、SpyCatcher-mi 3は大腸菌細胞質中で可溶かつ効率的に発現し、ニッケルカラム親和クロマトグラフィー及び寸法排除クロマトグラフィー（SEC）により精製される。ドデシル*-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）分析によると、SpyCatcher-mi 3ナノ粒子は単一の明瞭なストリップを呈し、SECクロマトグラフィーに単一の主ピークが観察され、構造が均一で純度が高いことを示した。負染透過型電子顕微鏡（TEM）によると、SpyCatcher−mi 3は、約26 nmの直径を有する、動的光散乱（DLS）で測定された流体力学的直径（図1 F、G）よりもわずかに小さい、予想される12面体球形粒子に組み立てられている。mi 3ナノ粒子の安定性を評価するために、SDS-PAGE分析を行った。mi 3ナノ粒子を37、25、4及び？80°Cで1週間インキュベートし、その潜在的な分解状況を評価した。

著者らはSpyTagをコドン最適化Epigraph HA遺伝子のC端に融合し、それをpCAGGSベクターにクローニングし、HEK 293 F細胞を瞬時にトランスフェクションし、Epigraph 0-SpyTag、Epigraph 1-SpyTag及びEpigraph 2-SpyTag抗原を得た。SDS-PAGE分析によると、3種類のEpigraph抗原はいずれも単一の明瞭なストリップを呈し、抗原純度が高いことを示している（図1 D）。安定性試験により、Epigraph抗原は37、25、4及び？80°Cで1週間インキュベート後も安定していた（図S 1 A）。

著者らはSpyTagをコドン最適化Epigraph HA遺伝子のC末端に融合し、それをpCAGGSベクターにクローニングし、HEK 293 F細胞を瞬時にトランスフェクションすることによりEpigraph 0-SpyTag、Epigraph 1-SpyTag及びEpigraph 2-SpyTag抗原を得た。SDS-PAGE分析によると、3種類のEpigraph抗原はすべて単一の明瞭なストライプを呈し、抗原純度が高いことを示している（図1 D）。安定性試験により、Epigraph抗原は37°C、25°C、4°Cと？

Epigraph−mi 3ナノ粒子（NPs）を作製するために、まずSpyCatcher−mi 3とEpigraph−SpyTagの異なる割合での結合効率を評価した。その結果、Epigraph−SpyTag量の増加に伴い、残留SpyCatcher−mi 3は徐々に減少することが分かった。注目すべきは、SpyCatcher-mi 3とEpigraph-SpyTagのモル比が1：4に達すると、SpyCatcher-mi 3の減少はもはや顕著ではなく、ステントが飽和に達し、過剰な未結合Epigraph-SpyTagが存在することを示している（図S 2）。これらの知見に基づいて、15μMのSpyCatcher−mi 3と60μMのEpigraph−SpyTag（mi 3 NPsステントとEpigraph抗原の比は1：4）を4°Cで一晩インビトロ結合反応させた後、SEC精製により未反応のEpigraph抗原と未結合のmi 3 NPsを除去した。図1 DのSDS-PAGEの結果、結合生成物Epigraph-mi 3はEpigraph抗原とmi 3より明らかに大きく、Epigraph抗原がmi 3 NPsに効果的に結合していることを確認した。この結果はSECクロマトグラフィーにおけるEpigraph−mi 3 NPsピークの前方シフトにおいてさらに検証された（図1 E）。同様の結果は、図1 FにおけるEpigraph 1−mi 3およびEpigraph 2−mi 3 NPsにも観察されている。DLS分析は粒子サイズ分布を確認し、Epigraph-mi 3 NPsの流体力学直径は未結合のmi 3 NPs（図1 G）より大きい。

また、すべてのEpigraph−mi 3ナノ粒子の多分散性指数（PDI）値は0.5未満であり、Epigraph−mi 3ナノ粒子が均一な寸法分布を有することを示している（表S 1）。

結果は、−80〜25°Cの試験温度範囲において、Epigraph−mi 3ナノ粒子は顕著な分解を示さなかった（図S 1 A）。示差走査蛍光法（DSF）の結果、Epigraph−mi 3ナノ粒子と対応するEpigraph抗原は類似の熱安定性を示し、ほぼ同じTm値を有し、これはEpigraph抗原とmi 3タンパク質の融合がその構造安定性に顕著な影響を与えないことを示した（図S 1 B）。ほとんどのワクチンは冷蔵条件下（2−8°C）で貯蔵することを提案しているため、本研究で構築されたナノ粒子ワクチンは通常のワクチン貯蔵条件下である程度の熱安定性を維持した。

議論

我々はT細胞エピトープ最適化技術とナノ粒子に基づく送達システムを用いて、Epigraphワクチンの開発に成功した。このワクチンはマウスモデルにおいて広範な抗体反応と強い細胞免疫反応を引き起こし、多種のH 9 N 2毒株の致死的攻撃に対して有効な保護を提供した。これらの研究結果により、Epigraphワクチンは汎用H 9 N 2ワクチンの候補として顕著な潜在力を持ち、H 9 N 2ウイルスの制御に重要な影響を与えることが明らかになった。

材料と方法

示差走査蛍光法（DSF）

PSA-16機器（北京佰司特科技）を用いて目標タンパク質の熱安定性を評価した。製造元の指示に従って操作します。簡単に言えば、1°C/minの昇温速度で30°Cから100°Cに直線走査し、330 nmと350 nmの波長で蛋白蛍光強度を測定した。熱転移中点（Tm）は、F 350／F 330の蛍光比曲線の傾きにより決定される。各サンプルを3回測定した。GraphPad Prism 9ソフトウェアを使用して1次微分データを描画します。

蛋白安定性分析器PSA-16

北京佰司特科技有限責任公司は2023年に自主開発した国産初の蛋白安定性分析器PSA-16を発売した。

PSA-16の性能とパラメータは輸入設備のレベルに達しているが、価格は輸入製品よりはるかに低く、現在の国産自主設備の蛋白安定性研究分析分野での空白を補っている。

主なパラメータ★測定パラメータ：Tm、Cm、ΔGなど、

★サンプル体積：≦20 uL、

★濃度範囲：0.01-200 mg/ml、

★温度制御範囲：15-110度、

★温度変化速度：0.1-15度/分、

★Tm重複性：CVが1%未満、

★消耗品パラメータ：使い捨て、洗浄不要、

★8連列設計、多チャンネルピペットの配合に適している、

蛋白安定性分析器PSA-16は内因性差動走査蛍光（ifDSF）技術に基づいて、蛋白質安定性研究、蛋白質系高分子薬物（抗体）最適化工程、蛋白質系疾病標的の薬物小分子スクリーニングと結合力測定などの分野に広く応用され、迅速、正確、高フラックスなどの多くの利点を有する。

PSA-16は紫外線二波長検出技術を採用し、蛋白質の脱折過程におけるトリプトファンとチロシン蛍光の変化を正確に測定し、蛋白質のTm値とCm値などのデータを得ることができる、測定時に染料を追加添加する必要はなく、緩衝液条件に制限されず、試験されたタンパク質サンプルの濃度範囲は非常に広い（10µg/ml-250 mg/ml）ため、スケーリング剤環境における膜タンパク質と高濃度抗体製剤の安定性研究に広く使用できる。さらに、PSA−16は非常に高いデータ収集速度を有しており、超高解像度のデータを提供することができる。同時にPSA-16は一度に最大16個のサンプルを同時に測定でき、フラックスが高い、各サンプルは15 uLしか必要なく、サンプル使用量が少なく、高スループットスクリーニングに最適である。PSA-16は操作が簡単で、使用後は洗浄する必要がなく、メンテナンスコストもほとんどありません。

蛋白安定性分析器PSA-16の応用は植物、生物学、動物科学、動物医学、微生物学、工業発酵、環境科学、農業基礎、蛋白質工学などの多学科分野をカバーしている。タンパク質は最終的に機能を決定する生体分子であり、その関与と生命活動過程全体に影響を与える。現代分子生物学、環境科学、動医動科、農業基礎などの多種学科研究の多くの方向は蛋白質機能研究、及びその下流の各種生物物理、生物化学方法分析に関連し、安定した蛋白質サンプルを提供することはすべての蛋白質研究の先決条件である。

1.抗体またはワクチン製剤、酵素製剤の高スループットスクリーニング

2.抗体またはワクチン、酵素製剤の化学的安定性、長期安定性評価、等温安定性研究など

3.バイオ医薬品類似性研究（Biosimilar Evaluation）

4.抗体カップリング薬（ADC）の研究

5.多構造領域の折り畳み解消特性の研究

6.物理的及び化学的条件による強制分解の研究

7.蛋白質変復性研究（復性能力、復性動力学など）

8.膜蛋白質洗浄剤スクリーニング、膜蛋白結合配位子スクリーニング（Thermal Shift Assay）

9.標的に基づく高スループット小分子薬物スクリーニング（Thermal Shift Assay）。（Thermal Shift Assay）。（model Shift Assay）。（model Shift Assay）。（model Shift Assa

10.タンパク質精製条件の迅速な最適化等

北京佰司特科技有限責任公司（https://www.best-sciences.com)

類器官直列チップ培養器HUMIMIIC、灌流式細胞組織系器官代謝分析器IMOLA、光学シート顕微鏡LSM−200、

タンパク質安定性分析器PSA−16、単分子質量光度系TwoMP、超高速ビデオ級原子間力顕微鏡HS−AFM、

全自動半導体式細胞計数器SOL COUNT、残留農薬定量測定器BST−100、卓上原子間力顕微鏡ACST−AFM、マイクロナノ加工点印計NLP 2000 DPN 5000、