肝−腎系器官の直列共培養による薬物試験

マイクロフロー制御チップに基づくヒト肝と腎近位管等価物の共培養を用いた反復用量多剤検査

多臓器マイクロフロー制御タンデムチップは組織系器官培養のマイクロ環境をシミュレーションし、類器官間のタンデム培養を実現し、種間の差異を減らすことができるため、この技術は将来性の広い臨床前薬物スクリーニングのための*ツールとなる。中国食品薬品検定研究院、安全評価研究所（国家薬物安全評価モニタリングセンター）、首都医科大学基礎医学院、北京市薬品検査研究院、ドイツベルリン工業大学はドイツTissUse GmbH社の科学者と協力し、マイクロフロー制御チップに基づく臓器モデルを構築し、肝臓と腎臓類の臓器を直列に接続し、16日間共同で育成することができる。同時に、シクロスポリンA（CsA）単独投与またはリファンピン併用投与に対して、14日間の反復用量の全身投与を行った。2種類の異なる用量のCsAの異なる標的器官に対する毒性特徴を比較し、14日間連続してcsAを用いた治療に比べて、6日目からリファイン併用投与を開始するとCsA濃度が低下し、毒性が軽減される。肝臓と腎臓系器官のクラス器官チップ上の直列共培養は、薬物開発の臨床前段階における多種類の薬物毒性スクリーニングの有効な転化ツールとしての潜在力を示している。

薬物による腎毒性と肝毒性は深刻な発病率と死亡率と関係がある。腎臓は電解質のバランスを維持し、ろ過、分泌、再吸収を処理する上で重要な役割を果たしている。腎近曲小管は能動輸送（再吸収または分泌）により外因性物質を除去し、これは機能性輸送タンパク質を発現する近端小管上皮細胞の強分極のおかげである。外因性物質の血漿濃度と生物利用度は肝臓の毒性/解毒作用によって変化し、腎臓毒性の変化を招く。だから。腎近曲小管と肝臓は毒性化合物の主要な標的である。現在、薬物腎毒性と肝毒性を証明するために使用されている臨床前モデルには、体外モデルと体内モデルが含まれる。しかし、動物モデルは育成時間が長く、動物倫理的な問題に限界があるため、静的条件下での伝統的な細胞培養方法は体内の微環境をシミュレートすることができない。

人体器官チップ技術の発展は現在の臨床前モデルの欠陥を克服し、3 R原則（すなわち動物の使用の代替、減少、最適化）を支持する。現在のクラス器官直列チップはマイクロフローポンプとクラス器官培養部分を集積し、液体と組織の割合が人体の中のものと類似するようにしている。肝−腎タンデムチップは、システム中の栄養物、化合物及び臓器代謝物の分布と交換を満たすため、2種類の臓器間の交流通信が保証される。

図1、マイクロフロー制御肝腎二器官直列チップ。（A）2つのマイクロ流路を収容するPDMSチップを含む装置の拡大図。（B）赤色太字矢印はマイクロ流路内の液体の流れ方向を示し、MOCにおける肝臓、腎臓系器官の共同培養の実験的設置。（C）16日間の共培養の概略図。2日間の適応期間と14日間の反復投与、毎日培地交換、1、7、14日目上清収集、0、14日目細胞サンプル収集を含む。

バランス安定性は、肝臓および／または腎臓損傷の異なる段階が観察されることを確実にする。共培養された肝臓系器官は、肝特異的マーカー、ヒト酵素、輸送タンパク質を発現し、そのレベルは2 D細胞培養と同等かそれ以上であり、少なくとも28日間維持された。

シクロスポリンA（CsA）は腎臓、肝毒性作用を有する免疫抑制剤であり、チップベースの肝腎共培養システムを刺激するためのモデル薬物として使用される。二重臓器チップ（2−OC）上の薬物代謝と毒性をさらに評価するために、CsAとリファンピン（RFP、肝酵素とトランスポーター誘導剤）の併用投与を用いた。CsAの薬理学、薬物動態と毒性に関する研究結果によると、異なる種の間には大きな違いがあり、特に代謝特徴において。そのため、臨床試験で使用された用量に応じて、2種類の異なるCsA用量（無毒/有毒用量）とRFP治療用量を2連器官直列チップに適用した。

私たちが知っている限りでは、これは最初肝−腎系臓器チップは、人体内における薬物の相互作用過程及び毒性への影響を効果的にシミュレーションすることができる。研究結果により、肝−腎系器官直列共培養チップは形態学、組織病理学、分子生物学、薬物代謝と非侵襲毒性生物マーカーの検査と結合し、薬物相互作用、代謝と毒性を解明することが期待されている。

結果

私たちは2つの同じマイクロ流路を収容できる2連器官チップを設計し、各回路は腎近端小管障壁とダーティ器官を直列に接続し、後続の共培養に用いた。（図1 A／B）。

腎近曲小管障壁の特徴、完全性と機能：RPEC/TERT 1細胞をtranswell上に壁を貼り付けて培養し、分化して完全な単細胞層を形成した（図2 A）。免疫蛍光染色の結果、RPEC/TERT 1細胞は汎上皮標識CK 8/18（図2 B、C）を明確に示した。アセチル化微小管タンパク質の染色により一次繊毛の形成が観察された（図2 D）。ZO−1（図2 G）とClaudin−10（図2 H）の細胞境界での発現は、隣接するRPTEC／TERT 1細胞間の緊密な結合の形成を確認し、適切な細胞分極と障壁の完全性を示した。Ki 67の陽性染色（図2 I）は増殖した細胞を示した。

2−OCs中の16日間の培養中に、遺伝子発現変化の対照として機能性トランスポーターMRP−2、P−gp、Ki 67のRT−qPCR解析結果を図2 J−Lに示す。

図2、腎臓近位小管障壁の特徴。（A）Transwell上に腎近位管単層細胞が形成された。細胞核はDAPI（青色）で染色される。スケール：B、D、E：100μm、C、F、G、H、I：50μm。（J）MRP−2（K）P−gp（L）Ki 67の遺伝子発現に対してqRT−PCR分析を行った。データは平均値±標準誤差であり、実験は3回繰り返した。

肝の特徴と機能：HepaRG細胞の形態と分化、肝球の形成、免疫蛍光染色及び肝臓機能酵素とトランスポーターのRT-PCR分析を付録にした。図1.結果により、マイクロフロー制御多臓器直列チップ中の肝球体は長期維持と繰り返し分化できる特徴があり、細胞増殖、分化とアポトーシスの間に平衡を達成し、それにより肝球体の生理平衡を実現した。

腎臓系器官（排泄システムを代表する）とマイクロ流路（血液循環の代わりに）におけるLDHレベルの検出結果は（図3 A）二器官チップにおける排泄システムと血液循環におけるLDH産生レベルが安定していることを示し、これは16日間の共培養中に異なる培養腔内の細胞に人為的であるが安定した生理的置換が発生したことを示している。

16日間の共培養中、2つの培地におけるグルコースレベル測定結果を図3 Bにまとめた。マイクロ流路通路と培養チャンバのグルコース濃度は2.5 mMから6 mMの間に厳密に維持され、二重臓器チップに十分なエネルギーを提供することを確保する。近位小管腔内のグルコースレベルは初期培地中の17.5 mMより約3倍低下した。マイクロ流路循環中のグルコース濃度は、正常血糖の範囲内である初期11.1 mMの50%まで低下し続けた。これらの発見は、16日間の肝−腎ストリング共培養期間中に、二重臓器チップが非常に安定したグルコースバランスを確立したことを示している。

図3、16日以内の肝腎系器官共培養システムの表現。（A）2−OCシステムにおけるシステム組織活性は、マイクロ流路（赤色）及び近位小管腔（黄色）乳酸脱水素酵素（LDH）収量によって表される。破線は、肝臓部位（赤色）および近位小管腔内（黄色）に毎日添加される培地の初期グルコース濃度を表す。（C）循環培地中の乳酸収量とグルコース消費量を測定することにより、共培養の代謝活性を測定する。

共培養システムの代謝活動を評価する指標として、マイクロ流路通路におけるグルコース消費量と乳酸生成量を用いた（図3 C）。2−OC系の新陳代謝活動は二相曲線を呈し、2日前に投与されなかった場合、新陳代謝活動は低下し続けたが、0日目からは新陳代謝活動は安定状態に入り、やや変動した。マイクロ流路における乳酸生成量のわずかな低下は、肝球と近位小管障壁との間に条件効果があることを示唆する可能性がある。

細胞の活力と代謝曲線は、2-OCシステムが肝臓、腎臓類器官を16日間同時に、連続的に培養することができ、同時にその活力と特徴機能を維持することができることを証明している。繰り返し性が高く、安定性が高い方法でマイクロフロー制御接続の直列共培養システムを構築することは、後続の実験にこれらの物質を応用するのに有利である。

チップに基づく肝−腎系直列培養システムの14日間反復用量薬物暴露モデル：チップベースの肝−腎ストリング共培養モデルをCsAまたはCsA結合RFPで処理し、異なる程度の毒性脅威下での器官間の相互作用を観察した。肝器官代謝後のCsA（図4 A）またはRFP（図4 B）濃度は、投与初日（1日目）と最終日（14日目）、および併用投与初日（7日目）の24時間後にサンプリングして測定した。図4 Cに示すように、1日目、7日目、14日目の投与後24時間において、用量レベルが5 uMから20 uM肝系器官に増加するにつれて、マイクロ流路通路のCsA曝露が増加した。反復投与7日後24時間のCsAレベルは、第1および最終投与後のレベルより低かった。最初と最後の併用投与後、20 uMCsAと25 uM RFPを全身併用投与すると、マイクロ流路通路中のCsA濃度が低下した。同時に、毎日併用投与8日後にRFPの濃度が増加し（図4 D）、RFPがマイクロチャネル通路に蓄積されていることを示した。肝・腎系器官への毒性物質の影響を評価するために、乳酸脱水素酵素（LDH）の放出を検討した。LDHは体外腎毒性を評価する信頼できるバイオマーカーとして、2つの培地で測定した。1日目、7日目、14日目には、シクロスポリンA（CsA）濃度の増加に伴い、マイクロ流路通路中のLDH濃度が徐々に増加した（図5 A）。25 uM RFPの8日間の併用投与後、20 uM CsAの全身投与による血路中LDHレベルの低下は、マイクロチャネル通路中のCsA濃度と一致した。しかし、慈悲深いこの低下は併用投与後に観察されなかった（図5 A）。実験の終わりに、併用投与群のp 53遺伝子発現は未処理対照群より1.5倍増加したが、Ki 67の発現に変化はなかった（図5 B、C）。慈悲深い併用投与後、未処理対照群と比較して7日目のIDHレベルは上昇を続けた（図5 H）。しかし、RFPを8日間併用した後、LDHレベルの急激な低下が観察された（図5 H）。同時にCsAとRFPで処理した腎系器官では、Ki 67遺伝子の発現量は2.7倍増加したが、実験終点では、低用量群と高用量群のKi 67発現量はいずれも顕著に低下した（図5 I、J）。図5 D-Gに示すように、TUNEL/Ki 67/DAPT三重染色はCsA曝露による細胞死の増加を示し、CsAとRFPを併用した肝海綿体では細胞死の緩和が観察された。Ki 67陽性染色により観察された増殖細胞は肝球中に均一に分布し、チップ中に保持され、異なる処理群間に顕著な変化はなかった（図5 D−G）。

通常および新規非侵襲毒性バイオマーカーのタンパク質発現：臓器特異的毒性の早期検出と診断におけるMOCプラットフォームのさらなる応用を探るために、本実験における薬物誘導肝臓および腎臓損傷を決定するために、臨床実践に使用されることが承認された通常および新規バイオマーカーを検出した。バイオマーカーの水平変化の観察結果を補足表3に示す。

図4、毎日投与または併用投与後のCsAとRFPの濃度測定、および2−OCにおける肝−腎系器官の代謝。（A）循環媒体中のCsAの質量スペクトル。（B）循環培地におけるRFPの質量スペクトル。矢印はRFPの特徴的なピークを表す。（C）毎日反復投与、併用投与後の循環媒体中のCsA濃度、および2−OCにおける1、7、14日目の肝−腎系器官の代謝。（D）併用投与後の循環媒体中のRFP濃度、および7日目と14日目の2−OC中の肝−腎系器官の代謝を毎日繰り返した。実験はそれぞれ対照群と低用量群で3回繰り返し、高用量群と併用投与群で4回繰り返した。*（#）または*（###）は、それぞれp値が0.05未満または0.01未満の有意差を表します。*または#は、それぞれ対応する対照群または併用投与群と高用量群との比較の差異を示す。

マイクロ流路中のバイオマーカー（図6）、肝酵素ASTは用量依存性の上昇を示し、併用投与群のASTレベルはRFPではなく終点にあるSHOU CIは投与後に低下した。TBiIの顕著な増加はRFP後の段階でのみ観察された。マイクロ流路通路におけるグルコースの低下は用量依存性を示し、これらの分子は7日目の高用量群と14日目の両治療群で統計学的に有意なレベルに達した。20 uMCsAとRFPを併用した治療後、併用投与段階で代用血回路中のグルコース濃度が上昇した。代替血中の腎毒性バイオマーカーCRE及びUREAは1日目に増加したが、7日目及び14日目に薬物に関連する変化は認められなかった。AB、GGT、LacのレベルにCsAに関連する変化は見られなかった。

排泄システムにおけるバイオマーカー：排泄媒体（図7参照）において、GGT（γ−グルタミルトランスフェラーゼ）レベルは初日に用量依存性の増加を示した。しかし、7回連続CsA治療後、高用量群のGGTレベルは明らかに低下し、14日目にも同様の効果が観察された。RFPとの同時治療は7日目と14日目にGGTレベルの低下を招くことはなかった。

図5、肝−腎系臓器直列チップにおけるCsAの1日単独または14日間の同時使用の毒性プロファイル。（A）血液培地中のLDH活性を1、7、14日目に代用した。qRT−PCR分析実験の終点における肝臓球体内（B）p 53（C）Ki 6遺伝子の発現。実験終了時、（D）対照群、（E）低用量群、（F）高用量群及び（G）併用投与群肝球形細胞のTUNEL/Ki 67（緑色/赤色）染色。（H）1、7及び14日目排泄媒体中のLDH活性。データは平均値主±標準偏差であり、実験はそれぞれ対照群と低用量群で3回繰り返し、高用量群と連合投与群で4回繰り返した。*（#）または*（###）は、それぞれp値が0.05未満または0.01未満の有意差を表します。*または#は、それぞれ対応する対照群または併用投与群と高用量群との比較の差異を示す。

CsA用量の増加に伴い、尿中のNAG酵素も分泌される。排泄槽中のALPに対するCsAとRFPの影響は類似している。CsA作用の下で、グルコースは用量依存性が低下し、併用投与群のグルコースレベルはCsA治療群より低かった。CsA治療後のLac濃度は明らかに上昇したが、RFPはLac分泌に対するCsAの影響を軽減した。

図6、肝−腎直列培養チップ中でCsAを1日単独または14日間同時に使用した後、マイクロ流路通路中の非侵襲毒性バイオマーカーのタンパク質発現。データは平均値主±標準偏差であり、実験はそれぞれ対照群と低用量群で3回繰り返し、高用量群と連合投与群で4回繰り返した。*（#）または*（###）は、それぞれp値が0.05未満または0.01未満の有意差を表します。*または#は、それぞれ対応する対照群または併用投与群と高用量群との比較の差異を示す。
KIM-1は腎臓特異性バイオマーカーであり、規制機関の正式な鑑定により、研究期間全体で用量依存性が上昇し、CsA媒介のKM-1上昇は時間とともに弱まり、RFPを服用する場合も同様である。排泄媒体中のCysCおよびColI IVレベルについても同様の結果が得られた。しかしRFP後の段階では、RFPはColI IVの役割を強化する。CsA治療後、CluとNGALの濃度は明らかに上昇し、RFPはCluとNGALのレベルを明らかに低下させた。実験期間中、OAの分泌レベルは持続的であり、高用量群のOAレベルはより高いレベルに維持された。併用投与群のOA低下は遅延顕著であった。同様に、20 uM CsAで処理した後、IP-10は増加したが、RFPは第14天使IP-10でやや低下した。CsAによって誘導されるGST−aおよびアルブミンレベルの用量依存性の増加は、1日目にしか観察されなかった。CsAはFABP-1を増強し、RFPを用いた低下は後期（14日目）まで観察されなかったが、RENとa 1-MGは7日目と14日目に同様の薬物誘導変化を起こした。1日目には、CsAはOPNの増加を引き起こすことができるが、用量とは関係なく、7日目にはOPNの増加は用量と関係がある。OPNに対するCsAの影響は14日目に消失したが、RFP誘起OPNの顕著な低下はRFP後の段階で維持された。TIMP−1は1日目に用量依存性の有意な増加を示した。RFP後の段階では、CsAはTIMP-1レベルの増加に対して異なる程度の弱体化を示した。CsAを用いた治療またはRFPを併用した治療後、EGFは用量依存性の低下を示す。CAIBおよびTFF-3には薬物関連の変化は観察されなかった（データは示されていない）。

図7、肝臓−腎直列培養チップ中でCsAを毎日単独または同時に使用した14日後、排泄腔内の非侵襲毒性バイオマーカーのタンパク質発現。（A）CGT（B）ALP（C）NAG（D）グルコース（E）乳酸塩（F）KIM−1（G）システインCの蛋白質レベル（H）コラーゲンIV（I）凝集素（J）NGAL（K）コラーゲン（L）IP−10（M）GST−a（N）アルブミン（O）FABP−1（P）エピニン（Q）α1−ミクログロブリン（R）コラーゲン（S）TIMP−1（T）1日目、7日目、8日目に培地中の表皮成長因子14を排泄した。データは平均±SEMであり、実験はそれぞれ対照群と低用量群で3回繰り返し、高用量群と連合投与群で4回繰り返した。*（#）または*（###）は、それぞれp値が0.05未満または0.01未満の有意差を表します。

代謝酵素とトランスポーター遺伝子発現の変化：本研究では、2つの種類の器官において発現される機能酵素とトランスポーター、および解毒または毒化過程におけるその役割をさらに研究した（図8）。実験終了時にRFPを併用すると肝臓、腎臓系器官におけるMRP-2の発現が顕著に誘導された。RFPと同時投与後、肝球体中のPgp遺伝子の発現はわずかに増加した。対照的に、RPEC/TERT 1細胞中のP-gp遺伝子発現はシクロスポリンA（CsA）の連続使用により顕著に誘導することができ、併用投与群ではP-gp遺伝子の誘導は観察できなかった。

図8、肝−腎ストリング共培養チップ中でRFPを毎日単独または同時に14日間使用した後、肝球と近位小管障壁中の代謝酵素とトランスポーターの遺伝子発現。実験終了時、肝臓（A）MRP−2（C）Pgp（E）CYP 3 A 4（F）BSEPと腎臓内（B）MRP−2（D）P−gpのmRNA発現量の対照群と比較した折畳み変化。データは平均値±標準差であり、実験はそれぞれ対照群と低用量群で3回繰り返し、高用量群と連合投与群で4回繰り返した。*（#）または*（###）は、それぞれp値が0.05未満または0.01未満の有意差を表します。

CsA処理群では、CYP 3 A 4とBSEPの発現に統計学的意義と用量依存性の低下が観察された。BSEPに対するCsAの抑制作用はRHPの同時投与によりやや弱まり、CsA群と同時治療群の間のCYP 3 A 4には有意な差はなかった。

議論

最新の研究によると、臓器チップ技術は3次元（3 D）マイクロ環境を再構築し、人体器官と組織の構造、力学、生理と代謝特性を模擬することができる。分化したHepaRG（実質）とHHSteC（非実質）細胞を含む安定で反復的な肝系器官分化スキームを開発し、肝小葉構造、すなわち肝臓の機能単位を再現することができる。HepaRG細胞株は、ヒトシトクロムP 450（P 450）酵素に対する薬物の誘導作用を予測するためのインビトロモデルとして使用される。さらに、肝系器官を取り囲む流体せん断応力と間質圧力のシミュレーションは、タンパク質と酸素勾配に基づく安定した微小環境をチップ中で長時間維持するのに役立つ。また、ZO-1とClaudin-10を含む関連タンパク質の発現は、共培養過程全体において、近曲小管細胞障壁の緊密な結合組立と細胞極性が維持されていることを示している。

長い間、血清中のクレアチニン（CRE）と尿素（UREA）の測定はCsAによる腎毒性の診断に用いられてきた、しかし、本研究で観察されたように、これらのバイオマーカーは長時間分泌を示さないため、敏感ではなく不足している。ヒトRPEC/TERT 1細胞系は分極して緊密な単層を形成することができ、特定の組織の酵素と輸送タンパク質を発現するのに長い時間がかかることが証明されたため、薬物安全評価のinvitroモデルとして確立された。既存のチップベース肝臓−近曲小管共培養モデルは、2つの器官とチャンバ間の長期生理および分子通信を複製した。チップ中で共培養した近曲小管障壁等価物はいくつかのバイオマーカー、例えばKIM-1、CLU、OAとNGALを発現し、長時間の毒性評価に用い、体内の腎臓毒性暴露に対する反応を模擬した。FDAとEMEAは、体内で十分に記述されており、動物や人間の尿や血液中で検出できる8種類の非侵襲性腎損傷バイオマーカーを承認している。この8種類の合格したバイオマーカーの中で、KIM-1、アルブミン、Clu、TFF-3は急性腎小管変性に関連するマーカーと考えられている。

以前の研究と一致して、急性CsA誘導腎毒性に反応する残りのマーカー、排泄媒体中のGST-α、NGAL、OPN、GGT、NAG及びTIMP-1、及び代替血中のCRE及びUREAを含み、腎小管機能損傷のバイオマーカーに分類することができる。研究により、急性腎小管上皮損傷（CsAによる損傷と体内小管間質線維化を含む）に関連するOAの引き上げが明らかになった。OAの用量依存性の増加はOAを早期近曲小管損傷の敏感なバイオマーカーに分類する結論を支持した。主に肝臓で産生される尿α1−MGは、小管および糸球体損傷時に上昇する可能性がある。これらの分子はいずれも急性および特に慢性腎小管損傷のバイオマーカーであるため、これらの発見は治療末期に観察されたFABP−1およびα1−MGレベルの上昇を部分的に説明することができる。研究期間を通じて、高用量CsAはColIVを上方修正した。また、腎小管基底膜中でColIVが発現し、したがって、共投与群におけるColIVの上昇は、14日目のKi 67遺伝子発現誘導による腎上皮細胞の再生を示唆した。CALBは小腸に存在し、CsAの長期使用後に遠位腎小管で抑制される。したがって、CALBはインビトロおよびインビボ腎小管損傷のバイオマーカーとしてCsAの単回および反復治療に対する反応は薬物とは無関係である。これはSHOU CI報告書はマイクロフロー制御MOCプラットフォーム上で一連の合格と潜在的な非侵襲性腎毒性バイオマーカーを評価し、MOCが早期薬物開発において高フラックススクリーニングを行う能力と優位性を示した。
腸管障壁と糸球体等価物は、私たちの研究を改善し、最適化するために、4臓器チップなどの新しいMOCシステムに統合されます。CsAの低いバイオアベイラビリティは主に肝臓代謝によるものであり、一部の原因は腸管吸収である。バイオアベイラビリティの低下は、腸CYP 450酵素の誘導によって説明できる可能性が高く、この誘導は肝臓代謝の誘導より顕著に大きい。体内の腸肝循環に対するCsAの影響はMOCプラットフォーム上でシミュレーションされる。
結論
本研究で評価されたマイクロフロー制御多臓器チッププラットフォームは、接続された培地回路を通じて、非接触共培養を繰り返し、明確な肝球と腎近曲小管障壁を定義することができ、各構造はその人体対応器官より100000倍小さい。最後に、共培養された組織等価物は組織特異性のマーカー、酵素、輸送タンパク質を発現し、肝臓薬物代謝誘導剤RFPによって緩和される肝毒性と腎毒性を有するCsAによって挑戦することができる。現在、マイクロフロー制御チップに基づくプラットフォームは標準化されたマイクロ組織サイズと組織培養フォーマットに適しており、薬物スクリーニングに広く応用でき、さらに多くの規制機関に受け入れられている。

材料と方法

二重臓器チップの設計と製造：市販のマイクロ生理学的二重臓器チップ2−OCは、2つの96ウェル細胞培養プラグインによって集積される。2−OCの製造は、Wagnerらの説明に従ってTissUse GmbHによって行われる。回路中の流体の流れはWuらの修正によるチップ上のパルスマイクロポンプによって構築された。チップ上のマイクロポンプは、TissUse GmbHから供給される外部制御ユニットの圧縮空気によって駆動される。

ヒトHepaRG細胞系とヒト近曲小管細胞系RPEC/TERT 1（CRL-4031）はいずれもATCC（米国バージニア州マンナサスにあるATCC）から購入した。HHSteC細胞系はScienCell研究実験室（米カリフォルニア州カールスバッドにあるScienCell）から購入した。

肝臓類器官培養：HepaRG細胞をHepaRG培地で培養した（William’s medium Eを含み、10%ウシ胎児血清（FBS、Life Technologies、オーストラリアニューサウスウェールズ州シドニー）、2 mM GlutaMAX、10000 U/mlペニシリン、10000μg/mlストレプトマイシン、5µg/mlヒトインスリン（Sigma-Alldrich、米国セントルイス）、5×10-5 M水素化コチゾン半コハク酸塩（中国北京の国家食品医薬品監督管理局）。細胞培地およびその補充剤は、いずれもLife Technologies（米国カリフォルニア州カールスバッド）から購入した。HepaRG細胞培養は37°Cと5%CO 2条件下で、1日おきに培地を交換した。HepaRG培地中で細胞を2週間培養してHepaRG細胞分化を誘導することにより、壁貼り成長を達成した。その後、2%ジメチルスルホキシド（DMSO、Sigma−Aldrich、米ミズーリ州セントルイス）を含む分化培地を加えて2週間再培養した。HHSteC細胞はScienCell研究実験室（米カリフォルニア州カールスバッドのScienCell）から購入した星型細胞培地に広がっている。

ヒト肝球体の形成はWagnerらの前の記述に従って行われた。簡単に言えば、球体プレート孔384ウェル当たり50μlの0.1×104 HHSteC細胞と2.4×104 HepaRG細胞を含む細胞懸濁液（Corning Costar、米国ケナボンク）を入れた。細胞をCO 2インキュベータ中のロッカ上で3日間培養し、円形でコンパクトな球体を形成した。その後、球体を超低接着性24ウェルプレート（Corning Costar、米国ケナフォンク）に移した。40個の球を集めて2−OC系を形成する単一肝等価物。分化したHepaRG細胞の形態と肝球体の形成をEVOS XL Coreデジタル反転顕微鏡（Life Technologies、米カリフォルニア州カールスバッド）下で評価した。

腎近曲小管障壁モデルの構築：培地と補充剤はいずれもLife Technologies（米カリフォルニア州カールスバッドのLife Technologies）から購入した。ヒドロコルチゾンはSigma-Aldrich（米セントルイスのSigma-Aldrich）から購入した。
Transwell透過性ステント当たり100000個のRPEC/TERT 1細胞を栽培し、夜間に付着させることができる。その後、上室の培地を交換して未付着細胞を除去した。実験前に、栽培したステントを2−OC中で4日間、灌流条件下で3日間静的に培養した。2−OC内で、挿入膜を培養室底部の100μm上方に位置させて、媒体が近曲小管障壁の下を自由に通過することを確保した。EVOS XL Coreデジタル反転顕微鏡（Life Technologies、米国カリフォルニア州カールスバッドのLife Technologies）を用いてRPEC/TERT 1の細胞形態と分化を監視した。

チップベースの共培養：排泄槽中の培地は毎日交換する。循環上清の半分が置換されて収集される。16日間の共培養終了時に、肝臓又は近曲小管等価物の器官特異的機能マーカーを免疫蛍光及びqRT−PCRにより分析した。チップ上のマイクロポンプの設定周波数は0.8 Hzであり、結果として生じる流速は9マイクロリットル/分を超えない。

実験試薬：CsA（CAS番号：59865−13−3）を反復用量の共培養に添加して試験した。RFP（CAS番号：13292-46-1）をCsAと同時に投与した。備蓄液については、CsAとRFP（中国国家食品医薬品監督管理局-北京）をDMSOに溶解し、4°Cで暗部に貯蔵し、使用時に最終濃度0.1%のDMSOに希釈した。

3日間の薬物適応性のない共培養後、CsA備蓄液は10µM（低用量）と20µM（高用量）のそれぞれの濃度の新鮮な培地に希釈され、1日13日間投与された。併用投与群では、6日目まで毎日20µMCsAを投与し、6日目から13日目まで毎日20µMCsAと25µMRFPを同時に投与した。0.1%のDMSOを含む培地を対照培養に用いた（図1 C参照）。

共培養分析：上清サンプル：細胞活性は、肝臓及び近曲小管障壁隔室における上清の乳酸脱水素酵素（LDH）活性を毎日測定することにより監視した。1日目、7日目、14日目に、液体クロマトグラフィー-直列質量分析（LC-MS/MS）を用いて代替血循環中のCsAとRFPの濃度を分析し、2つの隔室上清液中の毒性バイオマーカーを検出した。LDH、グルコース、アスパラギントランスアミナーゼ（AST）、アルカリホスファターゼ（ALP）、γ−グルタミルトランスフェラーゼ（GGT）、N−アセチル−β−D−グルコシダーゼ（NAG）、総ビリルビン（TBiL）、アルブミン（ALB、血清）、クレアチニン（CRE）、尿素（UREA）を含むバイオマーカーの検出は、日立7180自動生化学分析器（日本）を用いて行った。上記マークのキットはワコ（日本）から購入。骨活素（OA）、グルタチオン−S−トランスフェラーゼα（GST−α）、KIM−1、脂肪酸結合蛋白質−1（FABP−1）、IV型コラーゲン（Col IV）、好中球ゼラチン関連脂肪酸カルシウム蛋白質（NGAL）、コロニー（Clu）、システインC（Cys C）、レニン（REN）、α1−ミクログロブリン（α1−MG）、骨格蛋白質（OPN）、好中球ゼラチン関連脂肪酸カルシウム蛋白質（NGAL）、カルシウム結合蛋白質（CALB）、金属プロテアーゼ組織阻害剤−1（TIMP−1）、インターフェロン誘導蛋白質−10（IP−10）、三つ葉因子−3（TFF−3）、表皮成長因子（EGF）及び尿アルブミンの測定には、Merck Millipore（米国マサチューセッツ州ビラリカ）のMILLIPLEX MAPヒト腎損傷磁石ビーズプレート1及び2を用いた。これらの検出は、メーカーの指示に従って、米テキサス州のルミネックス200で実行される。データはMILLIPLEX Analyst 5.1ソフトウェア（米マサチューセッツ州ビラリカ）で分析した。

投与前後の組織培養分析：RPEC/TERT 1細胞を含む肝球体と膜はO.C.T.化合物中に凍結され、さらに分析するまで−80°Cで保存された。染色のために、スライスはまず−20°Cのアセトンで10分間または4%のPFAで10分間固定した。その後、スライス洗浄を3回行い、蛍光標識の二次抗体と常温で1時間インキュベートを続けた。核はDAPI（Sigma−Aldrich、米ミズーリ州セントルイス）で染色した。
増殖とアポトーシスをTUNEL/Ki 67の免疫蛍光染色により分析した。簡単に言えば、スライスにはTUNEL技術（ApopTag 1ペルオキシダーゼinsituアポトーシス検出キット、Merck Millipore,ドイツのダルムシュタット)メーカーの指導に従って染色を行った。核はDAPIで染色する。すべての免疫蛍光画像は、Image-Pro Plusソフトウェア（バージョン6.0、Media Cybernetics Inc.、米国メリーランド）と組み合わせて、ニコンEclipse 80 iデジタル蛍光顕微鏡（日本東京）とオリンパスIX 71リバース顕微鏡（日本東京）を用いて取得した。
肝球および近曲性小管細胞中の総RNAは、RNeasy@Micro Kit（Qiagen、ドイツのデュッセルドルフ）を用いて抽出される。qRT−PCR増幅はLine Gene 9620モデルFQD−96 A（Bioer）上で行い、SYBR Green検出（Tiangen Biotech、中国北京）を使用した。プログラムは、キットの製造元ガイダンスおよびデバイスに含まれるソフトウェアに基づいて実行されます。データ解析はソフトウェアバージョン2.0.6を使用して行われます。mRNAレベルの変化は、2−ΔΔCT法により決定される。プライマーはSangon Biotech（中国北京）が購入した。TBPとβ−actinは肝球と近曲小管障壁の内参遺伝子である。標的遺伝子のプライマー配列を補足材料表1に示す。

統計解析：統計評価にはGraphPad Prism（バージョン6.0、カリフォルニア州サンディエゴ）とSPSS（バージョン17.0、IBM，米ニューヨーク・アムンク）で行われた。P値は一方向分散分析後、学生t検定により算出された。特に記載がない限り、すべてのデータは平均±標準誤差で提示される。

受領日：2019年11月18日、受付日：2020年4月15日

リリース日：2020年6月1日